来源：丁香学术
2024 年 5 月 29 日，美国 Howard 研究所/麻省理工张锋院士团队与日本 Osamu Nurek 团队在Nature合作发表研究「Structural basis for pegRNA-guided reverse transcription by a prime editor」一文。该研究展示了 SpCas9-M-MLV RTΔRNaseH-pegRNA-target DNA 复合物在多个状态下的冷冻电镜结构，为先导编辑系统的机制解析和工具开发奠定理论基础 [1]。
2024 年 8 月 28 日，张锋团队在Cell发表研究论文「Structural insights into the diversity and DNA cleavage mechanism of Fanzor」。该研究工作首次报了 Fanzor（Fz），作为一种在真核生物中广泛存在的 RNA 引导的内切核酸酶，在物种分布和分子结构方面的多样性，并具体阐述 Fz 通过改变功能结构展示出的基因编辑潜力，为未来基因编辑工具的设计提供了新的思路 [2]。
仅隔一日，2024 年 8 月 29 日，张锋团队在Science重磅发表「Phage-triggered reverse transcription assembles a toxic repetitive gene from a noncoding RNA」 一文（图 1）。该研究工作报道了原核生物中由噬菌体触发，利用非编码 RNA 逆转录生成毒性串联重复序列，并组成新的启动子和开放阅读框，促进毒性重复蛋白的转录表达和终止感染反应的过程和机制 [3]。
图 1 相关研究（图源 [3]）
中心法则（Central dogma）是现代分子生物学的重要基础，最早由弗朗西斯 · 克里克（Francis Crick）提出（1958 年），描述了遗传信息在生物体内的传递过程。经典的中心法则包括复制（replication），转录（transcription）和翻译（translation），揭示了 DNA、RNA 和蛋白质之间的信息流动路径 [4]。1970 年，美国科学家霍华德 · 马丁 · 特明（Howard Martin Temin）和戴维 · 巴尔的摩（David Baltimore）同时分别在逆转录病毒中发现了逆转录酶（reverse transcriptase），证明遗传信息也可以从 RNA 流向 DNA，打破了原有「DNA→RNA→ 蛋白质」的单向流动观念，对中心法则进行了重要补充 [5]。
逆转录防御（Reverse Transcription in Defense）：通常指原核生物（如细菌）利用逆转录酶对抗噬菌体感染的一种生物学机制。本文中涉及的 DRT2（Type 2 Defense-associated Reverse transcriptase）防御系统是一种区别于 CRISPR-Cas 系统的细菌防御策略。与 CRISPR-Cas 系统通过切割入侵的噬菌体 DNA 不同，DRT2 系统通过逆转录，在噬菌体感染时生成编码毒性蛋白的序列，进而终止感染。
主要研究内容
1. 噬菌体可触发 DRT2 防御系统终止感染
DRT2 系统由一个 280nt 核苷酸的非编码 RNA（ncRNA）和其下游一个编码 425 个氨基酸（a.a.）的逆转录酶（RT）结构域蛋白组成（图 2A），在大肠杆菌中表达 DRT2 系统可以防御 T5 和 ZL19 噬菌体。DRT2 的表达不影响 T5 噬菌体对大肠杆菌细胞的吸附，也不影响 T5 感染细胞后的存活，主要通过减少病毒离子的产生和防止细胞裂解发挥作用。
2. DRT2 系统在噬菌体感染时通过逆转录 ncRNA 产生重复双链 cDNA
为证明 DTR2 系统的 RT 组分在噬菌体感染时可转录相关的 ncRNA，作者对 T5 噬菌体感染后的大肠杆菌（表达 DRT2）进行 PCR-free 长读长测序，证实 DRT2 的 RT 组分在触发噬菌体感染信号后可逆转录产生串联重复 cDNA（Concatemeric cDNA, cc DNA），图 2B-G。
图 2. 噬菌体入侵触发 DRT2 系统逆转生成 ccDNA 重复序列（图源 [3]）
3. DRT2 系统逆转录产生 ccDNA 通过重塑启动子发挥防御功能
为检测 ccDNA 的生物学功能，研究者首先对 42 个密切相关的 DRT2 ncRNA 序列进行比对，结果显示尽管整体 RNA 保守性很高，但编码 ccDNA 的模板区域在核苷酸水平的保守性最低（图 3A）。随后，研究者在 ccDNA 的模板区域进行了一系列突变实验，结果发现大多突变虽然可以维持 ccDNA 的生成，但表现出噬菌体防御能力的丧失。
进一步，研究者在 ccDNA 序列比对中发现了两个保守序列：TATAAT 基序位于模板 5' 端 12 nt 处， TTGACA 基序位于模板 3' 端 12 nt 处（图 3B）。在 ccDNA 中，相邻重复单元内的-10 元件与下一个重复单元的-35 元件精确地以 17 bp 的间隔相邻，重建了一个与强启动子完全匹配的启动子（图 3C）。突变-10 和-35 元件可以破坏 ccDNA 的启动子，从而消除噬菌体防御，此外，-10 突变体还可能抑制 ccDNA 的生成（图 3D-F）。
以上结果提示噬菌体感染后生成的 ccDNA 可以通过重建启动子，用于起始转录与原始非编码 RNA 不同的重复 RNA。这种启动子的重塑跨越了重复单元之间的连接，为噬菌体防御提供了一种独特的分子机制
图 3 DRT2 逆转录生成的 ccDNA 可进一步转录形成 RNA（图源 [3]）
4. DRT2 系统产生的 ccDNA 通过编码毒性 ORF 发挥噬菌体防御作用
为探索 ccDNA 编码蛋白的能力，研究者从 42 个与肺炎克雷伯菌 DRT2 系统密切相关的同源序列中推断出理论 ccDNA 序列，并发现每个 ccDNA 序列都包含一个跨越重复连接的单一阅读框，并且没有终止密码子（图 4A）。如果重复单元长度不是 3 的整数倍，会导致下一重复单元出现移码并产生一个终止密码子，消除噬菌体防御（图 4B-C）。
因此 ccDNA 编码的开放阅读框在噬菌体防御中具有重要作用，该基因仅在噬菌体感染的细胞中合成，且长度可能非常长（取决于 ccDNA 的重复量），因此被命名为 neo（永无止尽的 ORF）。NEO 蛋白序列与所有已知的的蛋白质结构域不匹配，结构预测显示其蛋白结构主要为低置信度的重复性 β 链或 α 螺旋结构（图 4D），且无酶活性。进一步，研究者将 neo 构建体转化至大肠杆菌，发现 neo 的表达可能通过产生有毒的重复蛋白可以抑制细胞生长，进而阻止噬菌体的传播（图 4 E-F）。
图 4 DRT2 ccDNA 编码的毒性 ORF（图源 [3]）
5. DRT2 系统产生 ccDNA 的分子基础
前序工作中，研究者发现噬菌体感染触发 DRT2 系统的逆转录酶（RT）将 DRT2 非编码 RNA（ncRNA）的模板区域逆转录成串联重复的 ccDNA，然后以 ccDNA 为模板转录（正向转录）成新的 mRNA，最终被翻译成毒性 Neo 蛋白终止感染。由于 neo 基因相对于原始 ncRNA 是「反义链 」，因此需要转录 ccDNA，这只有在双链 DNA 上才可能发生。因此，进一步研究者借助生化重建和冷冻电镜（cryo-EM）技术，探究了 DRT2 逆转录酶如何识别 DRT2 ncRNA 并选择模板区域产生 ccDNA 的分子机制。
为了解答这些问题，研究者在非噬菌体感染的细胞中使用 T7 启动子过表达 DRT2 操纵子，纯化后对该核糖核蛋白（RNP）复合物的进行成像，进一步结合结构、生化和测序分析详细解析了 ccDNA 的生成机制。作者发现 DRT2 RNP 执行 RNA 引物引发的反转录，该模板区域在刚性的 5' 和 3' 支架之间松散地保持。负链重复合成过程中，DRT2 RT 随机从 RNA 模板逆转录「跳跃」到 cDNA 模板 DNA 聚合酶活性，以进行第二链合成。产生的 ccDNA 表现为一个延长的发夹，并在功能上表现为双链 DNA（图 5）。这些发现为理解 DRT2 防御系统如何通过逆转录 ncRNA 产生具有防御功能的 ccDNA 提供了分子层面的见解。
图 5 ccDNA 合成的分子机制（图源 [3]）
研究总结与展望
与传统中心法则中 DNA-RNA-protein 遗传信息的单线性流动不同，本研究工作揭示了原核生物中的 DRT2 系统可通过逆转录酶（RT）组分对 ncRNA 的中心模板区域进行逆转录，产生可编码有毒蛋白的 ccDNA，来发挥噬菌体防御作用。DRT2 机制提示基因组以一种新的「暗物质」形式存在，这些基因仅在逆转录后才可见。DNA 本身并不直接携带编码信息，而是通过逆转录生成新的 DNA。新生成的 DNA 获得编码能力，随后被转录为 mRNA 并翻译为蛋白质。这种在 DNA 中不存在的 ORF 生成方式，为我们深度解析了一种全新的由噬菌体入侵触发，并以逆转录为核心的细菌防御的复杂机制。然而，目前还有很多关于 DRT2 防御系统的作用机制的重要问题尚无明确解释，例如 DRT2 系统如何感知噬菌体入侵（sensor），效应蛋白 NEO 如何发挥毒性抑制细菌生长等等，未来还有待深入研究与解答。
简介：（上下滑动查阅）
张锋，麻省理工学院（MIT）和哈佛大学布罗德研究所的核心成员，MIT 麦戈文脑科学研究所研究员和博德研究所研究员，是 CRISPR-Cas 基因编辑技术先驱之一。他因在基因编辑领域的开创性工作获得了包括 Lemelson-MIT 奖、唐奖和加拿大盖尔德纳国际奖等多项殊荣，并被选为美国国家科学院、国家医学院和美国艺术与科学院的院士。张锋的研究聚焦于开发基因编辑工具及其精确的载体，并应用于神经退行性疾病、免疫系统失调和衰老等领域，致力于为人类健康提供创新的治疗策略。
参考资料
[1] Shuto Y, Nakagawa R, Zhu S, Hoki M, Omura SN, Hirano H, Itoh Y, Zhang F, Nureki O. Structural basis for pegRNA-guided reverse transcription by a prime editor. Nature. 2024 Jul;631(8019):224-231. doi: 10.1038/s41586-024-07497-8. Epub 2024 May 29. PMID: 38811740; PMCID: PMC11222144.
[2]Xu P, Saito M, Faure G, Maguire S, Chau-Duy-Tam Vo S, Wilkinson ME, Kuang H, Wang B, Rice WJ, Macrae RK, Zhang F. Structural insights into the diversity and DNA cleavage mechanism of Fanzor. Cell. 2024 Aug 21:S0092-8674(24)00844-4. doi: 10.1016/j.cell.2024.07.050. Epub ahead of print. PMID: 39208796.
[3] Wilkinson, M. E., Li, D., Gao, A., Macrae, R. K. & Zhang, F. Phage-triggered reverse transcription assembles a toxic repetitive gene from a noncoding RNA. Science (2024) doi:10.1126/SCIENCE.ADQ3977.
[4] Cobb, M. 60 years ago, Francis Crick changed the logic of biology. PLoS Biol 15, (2017).
[5] Coffin, J. M. & Fan, H. The Discovery of Reverse Transcriptase. (2016) doi:10.1146/annurev-virology-110615-035556.
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图片来源：图虫创意
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