《食品科学》：宁夏大学剧柠教授等：原料乳冷藏过程中差异表达蛋白的表征与比较分析

原料乳在加工之前，为减缓腐败变质，通常会将原料乳置于4 ℃冷藏1～4 d。在此过程中，乳中的内源酶与微生物产生的外源酶会共同作用不断分解原料乳的营养物质，造成乳中蛋白质被降解为肽段和氨基酸，脂肪被分解为各类脂肪酸，乳糖作为乳中主要的碳水化合物也随之降解。物质的变化宏观上造成了牛乳的色泽、口感、风味及组织状态劣变。

近年来，组学技术在食品研究中得到广泛应用，蛋白质组学是其中重要的组成部分。基于数据依赖采集（DDA）模式的高通量蛋白质组学技术已被广泛应用于乳与乳制品研究中。数据独立采集（DIA）技术具有更高的重现性、灵敏度和检测范围，可在不考虑母离子信号的情况下，获得更完整的质谱数据，从而最大限度地检测牛乳中的低丰度蛋白。

因此，宁夏大学食品科学与工程学院的庄姣、剧柠*、朱晓雪等采用DIA技术探究原料乳4 ℃冷藏6 d过程中蛋白质的变化，分析差异蛋白质组成，并对不同冷藏阶段的蛋白质的生物学功能进行表征，从而为原料乳冷藏及乳制品的加工提供理论参考。

1 原料乳冷藏过程中的蛋白质鉴定及差异分析

1.1 蛋白质鉴定及定量

对3 个时间点样本的质谱数据进行平行样本数据合并和数据库检索，共鉴定得到902 种可信蛋白。利用PCA对冷藏d0、d3、d6期间原料乳中可信蛋白的表达量进行分析并绘制PCA得分图。如图1所示，横坐标为样本的第1主成分得分值，纵坐标为样本的第2主成分得分值。由图1可知，同一时间点的3 个平行样本的聚合度良好，不同时间点样本间距离较远且区分明显，表明冷藏d0、d3、d6的原料乳中的蛋白质组成存在显著差异。

1.2 不同冷藏阶段的差异表达蛋白分析

基于可信蛋白，以FC＞1.5或＜1/1.5，且

P

P

根据火山图（图2b、c），各阶段差异蛋白比较表明，冷藏前期下调蛋白数量（49 种）明显高于上调蛋白（21 种）。冷藏后期，上调蛋白质的数量较前期明显增加，有33 种；下调的蛋白质较前期有所减少，为38 种。

结合GO富集、KEGG富集及PPI分析，将具有重要生物学功能的差异蛋白列于表1。由表1可知，与冷藏前期相比，冷藏后期的差异蛋白质中具有生物活性的酶类明显增多。

2 差异表达蛋白的GO富集分析

GO数据库是进行基因功能注释的重要数据库。基于Fisher精确检验，在d 0 vs d 3比较组中，共有43 种差异蛋白被注释到了94 条显著富集的GO功能条目中（

P

P

基于生物过程、细胞组分和分子功能的GO功能分类方法，对冷藏前期和冷藏后期的差异蛋白分别进行GO功能富集分析，对于功能富集条目较多的生物过程、细胞组分，主要展示前10的功能条目。如图3、4所示，横坐标为

P

图3表明冷藏前期最显著富集的生物过程有对神经生长因子的反应、细胞对神经生长因子刺激的反应、细胞分化的正向调节和细胞成分组织的负调控；显著富集的细胞组分有片状伪足、细胞前缘和膜皱褶；显著富集的分子功能有蛋白质结合、泛素-蛋白转移酶活性和G蛋白活性。图4中，显著富集的生物过程有碳水化合物代谢过程的调节，RNA代谢过程，转录、DNA模板以及葡萄糖代谢过程调节等；与前期显著富集的细胞组分功能相似，冷藏后期的差异蛋白主要富集于片状伪足、细胞前缘和有丝分裂纺锤体；后期显著富集的分子功能有RNA结合、核酸结合、DNA结合转录因子结合和肌球蛋白结合等。

3 差异表达蛋白的KEGG富集分析

利用KEGG数据库对两个比较组中的差异蛋白进行代谢通路富集分析，分别富集到24 条和26 条代谢通路（

P

由图5a可知，吞噬体是冷藏前期（d 0vsd3）富集程度最高的途径（富集因子为8.40），BoLA、RAC1、COLEC12、CTSL、CGN1、SEC61B和CORO1A共7 种差异蛋白被注释到这一途径中。此外，冷藏前期的差异蛋白还参与了病毒致癌作用、Rap1信号通路、内质网蛋白质加工、胆固醇代谢、溶酶体、流体剪切应力和动脉粥样硬化及沙门氏菌感染等途径。

由图5b可知，冷藏后期（d3vsd6）磷酸戊糖途径的富集程度最高（富集因子为28.82），涉及的差异蛋白质有4 种，即PGM1、FBP1、PGLS、TALDO1，均为具有生物活性的酶。此外，冷藏后期（d 3 vs d 6）的差异蛋白还参与了结核病、唾液分泌、轴突导向、碳代谢、冠状病毒病-COVID-19、细菌侵入上皮细胞、核糖体、吞噬体和半乳糖代谢的代谢途径。值得注意的是，该阶段吞噬体途径的富集程度明显下降（富集因子为4.69），而与碳水化合物相关的碳代谢、半乳糖的代谢开始出现。

4 差异表达蛋白的PPI分析

通常情况下，蛋白质多以结合或相互作用的方式发挥生物活性功能，通过PPI分析能更好地了解蛋白质在生物系统中的相互作用关系。设置0.400为最低交互分数，绘制不同冷藏时期原料乳中的差异蛋白质的PPI图。如图6所示，圆圈为差异蛋白，根据该蛋白的相互作用degree值，中心向四周依次从大到小排列。蛋白质周围的连接线越多，圆圈越大，代表该蛋白越重要。

冷藏前期（d 0 vs d 3）的差异表达蛋白中有6 种中心节点蛋白（图6a），包括CDC42、NME2、RAC1、PAEP、ORM1、APOA4。NME2通过与AKAP13/LBC相互作用对Rho活性进行负调节；RAC1是一种与质膜相关的小GTP酶，在活性GTP结合和非活性GDP结合状态之间循环 。PAEP是乳清的主要成分，可以与视黄醇结合并参与其运输，而视黄醇等维生素多为脂溶性，因此，PAEP对视黄醇的运输作用可能是通过与脂肪结合 的形式实现的。ORM1是一种分子质量为37～54 kDa的蛋白，在血液中充当运输蛋白，具有调节免疫系统活性等功能 。可见，冷藏前期的中心节点蛋白多与细胞过程有关。图6b中，从冷藏后期（d 3 vs d 6）的差异表达蛋白中筛选获得了7 种中心节点蛋白，即CDC42、TALDO1、NME2、RPL11、RHOA、CLTC、RPS3。其中，TALDO1与8 种蛋白质相互作用，主要参与了糖代谢过程。RPL11、RPS3都为核糖体蛋白，在冷藏后期相互作用，且都被显著富集到了核糖体途径，表明冷藏过程中的这些核糖体蛋白可能在生物学功能中发挥着重要作用。值得注意的是，CDC42是两个冷藏阶段共有的关键节点蛋白，在冷藏前期表现为上调、冷藏后期表现为下调。作为Rho GTP酶超家族的重要成员，CDC42能参与许多重要的细胞活动过程，如丝状伪足的形成 、囊泡运输和有丝分裂纺锤体的调节 等。

随着冷藏时间的延长，原料乳中具有生物活性的酶会改变原料乳的品质，进而影响后续乳制品的加工。大量研究表明4 ℃可有效减缓原料乳的品质劣变，但无法避免该过程的发生。本研究对4 ℃冷藏前期（d 0 vs d 3）和冷藏后期（d 3 vs d 6）的原料乳采用蛋白质组学方法进行分析，从微观角度探究原料乳品质劣变的原因。结果发现，不同冷藏阶段乳中蛋白质变化复杂，且生物学功能存在较大差异，冷藏过程中的蛋白质主要行使细胞进程和代谢过程这两种生物学功能。

1）细胞进程。冷藏前期的差异蛋白主要参与了细胞的生物学过程。细胞过程离不开相关信号转导通路的调节。冷藏前期，Rap1信号通路被显著富集。研究表明，Rap1信号通路处于活跃状态时产生的下游效应分子RIAM（Rap1相互作用的衔接分子）有助于吞噬体作用。本研究中，CDC42与RAP1A、RAC1、RHOA不仅具有相互作用，且均参与了Rap1信号通路。这些蛋白在活跃的GTP状态和非活跃的GDP状态之间不断转换。当处于活跃状态的GTP酶与Rap1结合时，会激活Rap1/RIAM通路，从而促进细胞的吞噬作用。值得注意的是，CDC42在冷藏前期表达上调，表明此阶段Rap1与GTP酶结合的频率更高，使得Rap1/RIAM通路处于激活状态，吞噬作用明显。而冷藏后期，CDC42表达下调说明吞噬作用下降。Shrivastava等指出，吞噬作用是一种重要的防御机制，可以吞噬细菌、真菌、病毒等病原体，从而对抗有害微生物的感染。Botelho等指出，吞噬体可与溶酶体融合以获得杀灭微生物的一系列蛋白，这些蛋白质（如CLTC）主要存在于溶酶体内，通过融合作用进入吞噬体内发挥吞噬作用。本研究中，CLTC被同时注释到了吞噬体和溶酶体两种显著富集的代谢途径，使得冷藏前期原料乳中微生物无法迅速生长。王媛媛的研究表明4 ℃冷藏72 h，微生物生长缓慢，原料乳脂肪、蛋白质、乳糖等关键品质变化不显著。冷藏后期，吞噬体途径的富集程度显著下降，吞噬体作用减弱，该阶段嗜冷微生物迅速生长繁殖。微生物的生长使得原料乳中的营养物质被消耗，造成乳蛋白、脂肪和乳糖等营养物质减少，并导致酸味、涩味和苦味等不良风味的形成，从而影响原料乳加工前的品质。

2）代谢过程。随着冷藏时间的延长，乳中具有生物活性的蛋白参与的主要代谢途径为胆固醇代谢和糖代谢。胆固醇是哺乳动物体内合成的、能稳定细胞膜结构的重要脂质。本研究中胆固醇代谢途径仅在冷藏前期被显著富集（

P

P

P

结论

采用DIA蛋白组学揭示了4 ℃冷藏6 d原料乳蛋白质之间组成和功能的差异。冷藏过程中共检测到蛋白质902 种，其中冷藏前期和冷藏后期分别筛选到70 种和71 种差异表达蛋白。两个阶段仅23 种共同的差异表达蛋白，说明不同冷藏时期的蛋白质表达存在显著差异（

P

本文《原料乳冷藏过程中差异表达蛋白的表征与比较分析 》来源于 《食品科学》2023年45卷第 5 期225 - 232 页，作者： 姣，剧 柠*，朱晓雪，李亚凤，丁雨红，高 岩，陈彦辉，齐 瑾，杨秉坤 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20230608-068 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

作者简介

通信作者：

剧柠（1979—），研究方向为乳与乳制品加工；乳酸菌菌种资源挖掘与利用。入职以来先后从事乳品微生物快速检测、原料乳品质控制、功能性乳制品产品开发及地方特色菌种资源挖掘与利用方面的研究，成果成功先后转化于我区食品加工企业，成效显著。近3 年，主持国家自然科学基金项目2 项，自治区自然科学基金项目2 项；自治区重点研发项目（重大专项）1 项，自治区重点研发项目（课题）2 项，授权发明专利3项，先后荣获中国酒业协会科学技术奖二等奖、宁夏回族自治区科技进步三等奖各1 项；以第一作者或通讯作者发表高水平论文20余篇。

第一作者：

庄姣（1998—），女，学术型硕士研究生在读。2017—2021年就读于贵州大学生物工程专业，主修微生物发酵，取得学士学位；2021年9月进入宁夏大学食品科学与工程学院攻读硕士研究生，研究方向为乳与乳制品加工，目前课题研究的主要内容是基于蛋白质组学技术探究原料乳加工前冷藏过程中的品质劣变。2023年参加第九届“互联网＋”大学生创新创业大赛（研究生组）获校级金奖、省级银奖；获得2022-2023学年三等学业奖学金；以第一作者身份或参与发表学术论文5 篇（已录用）。

实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与陕西师范大学、新疆农业大学、浙江海洋大学、大连民族大学、西北大学于2024年10月14-15日在陕西西安共同举办“2024年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。

长按或微信扫码了解详情

为加强企业主导的产学研深度融合，促进食品科研成果转化和服务地方经济产业，由全国糖酒会主办，北京食品科学研究院、中国食品杂志社和中粮会展（北京）有限公司承办的“食品科技成果交流会”将于2024年10月29-31日糖酒会期间在深圳国际会展中心举办 ，以当前食品科技发展趋势和食品产业发展的重点科技需求为导向，针对食品产业发展面临的重大科技问题，交流和借鉴国外经验，为广大食品科研工作者和生产者提供新的思路，指明发展方向。

长按或微信扫码进行注册

会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）