多年来，浙江大学杨兵研究员实验室一直聚焦于使用共价捕获的方式，来研究弱的、瞬时蛋白质的相互作用。
之前，杨兵在从事博士后研究的时候，曾在美国加州大学旧金山分校王磊教授实验室开发了可富集的化学交联非天然氨基酸 EB3。
但是，EB3 主要和半胱氨酸反应，而半胱氨酸在自然界的丰度较低，这在一定程度上限制了 EB3 的使用。
所以，杨兵希望能在多氨基酸反应性的交联非天然氨基酸 FSY 的基础上，开发可富集的非天然氨基酸 eFSY。
通过开发 eFSY 他希望：
能在活细胞中以原位方式捕获蛋白质之间较弱的、瞬时相互作用；
能区分直接蛋白质与间接蛋白质相互作用；
能鉴定蛋白质相互作用的界面；
能提高蛋白质相互作用鉴定的灵敏度；
能鉴定出在其它技术中丢失的、或未被鉴定出的蛋白质相互作用。
例如，亲和纯化结合质谱鉴定技术是鉴定蛋白质相互作用的常用技术之一。
但是，该技术需要先对细胞或者组织样品进裂解。在细胞裂解的过程中，会破坏所有的亚细胞结构。
另外，裂解液也会极大地稀释蛋白质的浓度，这会导致真实蛋白质相互作用的丢失，以及导致假阳性蛋白质相互作用的产生。
在蛋白质纯化的过程中，为了去除背景信号，通常需要针对蛋白质纯化的磁珠进行多次清洗，然而这样会导致丢失相对较弱的瞬时蛋白质相互作用。
如果使用交联非天然氨基酸原位的共价来固定蛋白质相互作用，将在一定程度上避免上述问题的产生。
该团队遇到的第一个问题是如何高效大量的制备探针化合物 eFSY。唐士兵老师团队帮助快速地合成了足够研究使用的 eFSY，上海交通大学董佳家教授赠与了该课题组当时还没有商品化的氟磺酰化试剂用于 eFSY 的合成。
接下来遇到的问题是，如何筛选出来能够识别 eFSY 的氨酰-tRNA 合酶。
在丁文龙博士的帮助下，他们筛选到了能够识别 eFSY 的氨酰-tRNA 合酶。
此外，部分鉴定到的质谱图匹配非常差。后来，经过该团队的刘丹丹同学的人工解谱发现，这主要是因为 eFSY 和赖氨酸、组氨酸的交联产物在质谱中是可断裂的。
随后，刘丹丹和另一位组员程劲韬总结了 eFSY 和赖氨酸、组氨酸交联肽段碎裂的规律。
接着，程劲韬在北京航空航天大学刘超教授的指导下，开发了非天然氨基酸交联鉴定软件 AixUaa，借此提高了交联肽段的鉴定率和准确性。
与此同时，他们发现哺乳动物细胞中交联肽段的鉴定率极低，后来经过刘丹丹的大量优化，提升了交联肽段在哺乳动物细胞中的鉴定率。
杨兵表示：“在这个高通量组学研究的时代，软件成为数据分析中不可或缺的工具。但是，大多数同学过于习惯使用软件，以至于弱化了手工解谱的能力。”
而在这项研究中，刘丹丹能够静下心来，针对匹配比较差的谱图进行手工分析，借此发现 eFSY 和组氨酸、赖氨酸的交联是质谱可断裂的。
就这项研究来说，程劲韬同学是中途加入的，他本身有自己的独立课题。因此，当他加入这项研究的时候，注定他不会成为本次论文的第一作者。
“但是，劲韬还是不计个人得失放下自己的课题，全情投入到这项研究工作中，他的团队协作精神，让我十分佩服。”杨兵说。
另外，杨兵认为程劲韬超强的自学能力也让人叹服，在两年不到的时间，他完成了从生物学方向到软件和算法开发的转变。
杨兵继续说道：“我和刘超老师认识快 20 年，在我回国之后，他也建立了自己的课题组。合作中我们一直想联合培养一个能够做软件开发的学生。”
最初，杨兵从自己所在的浙江大学生命科学研究院选人，尝试了 4-5 名候选人之后都觉得不太合适。
“而劲韬本科毕业于浙大农学院，他加盟我们实验室之后，一直想做软件和算法开发，于是就选中了他。在劲韬的培养上，刘超老师也倾注了大量心血。”杨兵表示。
正是在这些努力之下，促成了本次论文的发表。
日前，相关论文以《使用可富集、可裂解和潜在生物反应性的非天然氨基酸鉴定蛋白质的直接相互作用》（Characterize direct protein interactions with enrichable, cleavable and latent bioreactive unnatural amino acids）为题发在Nature Communications[1]。
刘丹丹、丁文龙、程劲韬、韦秋实是共同一作，北京航空航天大学刘超教授、中国科学院广州生物医药与健康研究院唐士兵研究员、以及杨兵担任共同通讯作者。
总的来说，本次开发的 eFSY 和非天然氨基酸交联鉴定软件 AixUaa，能够显著提升蛋白质直接相互作用组的鉴定能力。
杨兵表示在重大疾病的治疗过程中，往往会产生耐药。耐药产生的部分原因是患者在长期用药之后，产生了一些新的非经典蛋白质相互作用，以至于影响了药物的疗效。
而本次所开发的技术，有望用于鉴定这类蛋白质的相互作用，从而帮助理解耐药的机制，在此基础之上有望开发新的治疗手段。
另外，蛋白多肽类药物在市场上占有越来越高的比重。
但是，这些大分子药物存在一定的脱靶风险，而利用本次技术可以帮助鉴定大分子药物非特异结合的蛋白质，从而对药物分子进行进一步的优化和改造。
就本次技术而言，杨兵想把非天然氨基酸交联和小分子化学交联进行联合使用，进一步提升交联肽段的鉴定能力，但是这会对软件分析提出更大的挑战。
因此，他们会针对非天然氨基酸的交联基团进行更进一步的优化。
除了炔基以外，他和团队也希望能够引入其它的基团来用于交联多肽的富集，以便能够简化实验流程。
另外，他也非常希望拓展这项技术在生物医学中的应用，将其用于耐药机制的研究、以及大分子药物脱靶效应的研究。
参考资料：
1.Liu, DD., Ding, W., Cheng, JT.et al. Characterize direct protein interactions with enrichable, cleavable and latent bioreactive unnatural amino acids.Nat Commun15, 5221 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-49517-1
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