蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种常见的食源性致病菌，可以通过污染面制品、乳制品等食品引起成人和婴幼儿食物中毒，危害人体健康。研究表明，B.cereus能够以营养细胞、芽孢和生物被膜3 种形态广泛存在于土壤、水、空气、食品等各种环境中。目前，巴氏杀菌、辐照等物理杀菌技术和以食品防腐剂为核心的化学抑菌方法是食品生产中常用的微生物杀灭和抑制手段。
随着消费者食品健康意识的增强，挖掘开发新的天然抑菌剂逐步成为研究热点。鼠李糖脂（RLs）是由铜绿假单胞菌发酵合成的次级代谢产物，是一种天然的阴离子糖脂类表面活性剂，具有抑菌、乳化、抗癌等多种理化特性和生物学活性。
基于此，河南工业大学小麦和玉米深加工国家工程研究中心的牛永武、乔杉、田双起*等以常见食源性致病菌——B.cereus的芽孢为研究对象，以抑菌圈、生长曲线、菌体外观形态、芽孢渗透性、相对电导率、生物大分子泄漏量、活性氧（ROS）含量、表面疏水性、吡啶-2,6-二羧酸（DPA）释放量以及DNA紫外光谱为评价指标，探究RLs对B.cereus芽孢的抑菌活性和作用机理，以期为推动RLs作为抑菌剂在食品工业领域的应用奠定基础。
1 RLs对B.cereus芽孢的抑菌活性评价
MIC和MBC分别可以反映抑菌剂对特定微生物的抑制和杀灭效果，是开发新型抑菌剂常用的评价指标。分别利用吸光光度法和平板涂布法测定RLs对
B.cereus芽孢态的MIC和MBC，结果见图1。如图1A所示，添加RLs质量浓度为0～64.0 mg/L时，接种芽孢态
B.cereus培养48 h后，培养液的OD 600 nm 增长均远超过5%。RLs质量浓度达到80.0 mg/L时，接种芽孢态
B.cereus培养48 h后，培养液的OD 600 nm 为0.104 8，与初始OD 600 nm （0.100 6）相比仅增加4.17%（＜5%），故确定RLs对芽孢态
B.cereus的MIC为80.0 mg/L。将对照组和添加不同质量浓度RLs培养后的菌液进行平板涂布（图1B），发现RLs质量浓度达到160.0 mg/L时，菌落总数降低3 个数量级，即160.0 mg/L RLs对芽孢态
B.cereus的杀死率达99.9%。因此，确定RLs对芽孢态
B.cereus的MBC为160.0 mg/L。
如图2所示，未添加RLs的芽孢在0～2 h处于延滞期，随后进入对数生长期，10 h后达到稳定期。加入1/2 MIC的RLs后，芽孢的延滞期延长至4 h，随后进入生长对数期，但生长速率减缓，10 h后达到稳定期。RLs质量浓度为MIC时，24 h内培养液持续呈澄清状态，芽孢生长被完全抑制，这与RLs抑制金黄色葡萄球菌的研究结果相似。为进一步验证RLs对
B.cereus芽孢的抑制作用，采用牛津杯法进行抑菌圈实验，结果如图3所示，MIC和MBC对
B.cereus芽孢抑菌圈直径分别为（9.77±0.09）mm和（11.29±0.31）mm，表明具有良好的抑菌效果。
2 RLs对B.cereus芽孢形态的影响
如图4所示，未经RLs处理的芽孢呈短杆状，表面有轻微皱缩，整体较为饱满但无明显异常变化。经MIC RLs处理后，部分芽孢表面出现褶皱和折痕，而经MBC RLs处理后的大部分芽孢表现出严重的皱缩和凹陷，且表面有泄漏的芽孢内容物，表明一定质量浓度RLs会引起
B.cereus芽孢外壁破损，破坏细胞膜的完整性，导致内容物泄漏，起到抑制芽孢生长或灭活的效果。
3 RLs对B.cereus芽孢内膜通透性的影响
由图5可知，对照组在显微镜下无荧光现象，表明PI未进入
B.cereus芽孢内部，细胞生长状态正常。芽孢经MIC和MBC的RLs处理后均观察到红色荧光，且MBC条件处理后的细胞红色荧光显著增强，表明RLs可以改变芽孢内膜通透性，且破坏程度与RLs浓度呈正相关。
如图6所示，所有组的芽孢菌液相对电导率随时间延长均有所升高，但对照组在4 h后基本不增加，而MIC和MBC RLs处理的芽孢菌液相对电导率呈现持续升高趋势，其中MBC组升高趋势更为显著。8 h时，MIC组相对电导率达到了20.86%，MBC组升至32.13%，进一步证实了RLs可以改变
B.cereus芽孢内膜通透性，引起芽孢内电解质的泄漏。
4 RLs对B.cereus芽孢内大分子释放的影响
由图7可知，对照组的OD 260 nm 和OD 280 nm 呈现较低水平，而RLs处理后的芽孢菌液OD 260 nm 和OD 280 nm 明显升高，且随着RLs浓度增大和作用时间延长而提升，表明RLs对芽孢各层的通透性和完整性有明显的破坏作用，导致核酸和蛋白质大量外泄，引起功能紊乱，影响芽孢生长。
5 RLs对B.cereus芽孢内ROS的影响
如图8所示，RLs处理60 min后，滤液的荧光强度开始显著升高，且MBC处理组的荧光强度始终高于MIC组，表明RLs可以导致
B.cereus芽孢产生氧化应激反应，引起芽孢发生不可逆损伤和死亡。
6 RLs对B.cereus芽孢内DPA释放的影响
未处理的菌液经过121 ℃加热20 min后，芽孢内DPA全部释放，此时测得芽孢内DPA的总量为（166.83±1.44）μg/mL。由图9可知，RLs处理会引起DPA的释放，且高质量浓度的RLs促使DPA释放量达到（86.11±2.01）μg/mL，约占总量的51.61%，表明RLs可以有效降低芽孢的耐热性，从而加速芽孢损伤和失活。
7 RLs对B.cereus芽孢表面疏水性的影响
根据表1可知，未经处理的
B.cereus芽孢的疏水芽孢比例（RHS） 59.938%，表现出较强的疏水性。而经RLs处理后，芽孢RHS显著降低，MIC组降低至12.310%，MBC组下降至10.792%，分布在正十六烷中的芽孢比例显著降低，芽孢表面由疏水向亲水转变。表明RLs可以降低芽孢与疏水表面和界面黏附能力，为减少
B.cereus芽孢在食品加工中的污染提供潜在可能。
8 RLs对B.cereus芽孢DNA的影响
由以上结果可知，RLs具有透过芽孢内膜进入内部结构的潜力，猜测其可能与DNA发生作用，利用紫外光谱探究RLs与DNA之间的相互作用。从图10可以看出，
B.cereus芽孢DNA的最大紫外吸收峰随着RLs处理质量浓度的增加呈降低趋势，发生减色效应，表明RLs可以与
B.cereus芽孢DNA分子发生作用。分析原因可能是RLs作为小分子物质竞争性地插入DNA的碱基对中，致使碱基对脱落，进而降低紫外吸光度 。
结 论
本实验针对RLs对
B.cereus芽孢的抑菌活性及芽孢壁膜的破坏作用展开研究，发现RLs可以有效抑制芽孢态
B.cereus的生长，MIC和MBC分别为80.0 mg/L和160.0 mg/L，具有良好的抑菌活性。进一步研究RLs对芽孢态
B.cereus的抑制机制，发现RLs处理后引起芽孢出现严重皱缩、凹陷和内膜破裂，导致芽孢内容物外泄。同时，RLs对芽孢内膜通透性和完整性均发生破坏，引起芽孢内电解质、核酸以及蛋白质等生物大分子物质的大量泄漏，导致芽孢的正常新陈代谢紊乱甚至失活。此外，RLs处理促使芽孢核心内的DPA大量释放到外界环境中，显著降低了芽孢抗性。RLs处理后的芽孢内ROS大量堆积，表现出氧化应激现象，降低菌体的代谢活性。RLs能够有效降低芽孢的表面疏水性，从而降低其黏附能力，还可以与芽孢DNA相互作用并发生减色效应，导致菌体DNA结构受损，对DNA的功能造成干 扰。
整体来看，本研究从细胞水平阐述了RLs对
B.cereus芽孢形态的抑菌效果及机理，揭示了RLs可有效灭活芽孢的萌发，并对其各层结构均产生破坏作用；同时，RLs可以通过降低芽孢黏附性及热抗性、加速胞内大分子物质外泄、产生氧化应激反应等多种途径对芽孢造成损伤，可为RLs的抑菌研究提供理论依据。目前，为减少抑菌剂的使用量，多种杀菌技术联合应用已逐步成为杀菌行业的关注点，后续可以对RLs与其他抑菌剂或物理抑菌方法的联合应用展开深入研究。
本文《 鼠李糖脂抑制芽孢态蜡样芽孢杆菌的活性及机制 》来源于 《食品科学》2023年44卷第 22 期 138 - 148 页，作者：牛永武，乔 杉，孙艺铭，王雨辰，赵仁勇，田双起* 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20230215-144 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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