来源：小张聊科研
中性粒细胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps，NETs）是中性粒细胞在受到特定刺激时释放的一种由 DNA、组蛋白和颗粒蛋白组成的网状结构。在国自然竞争愈发激烈的当下，该领域内的资助力度逐年加大。
今天就同大家来解析一下 NET 相关的研究应该怎么做，从一篇山东大学齐鲁医院等团队发表在 Cellular & Molecular Immunology（IF 21.8）杂志的文章说起，看看大家能否理解其中的思路，并拿来一部分借鉴到自己的课题中去。
主要研究内容
本研究探讨了乙醛脱氢酶 2（ALDH2）（关键蛋白）在脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）（疾病模型）中的作用，发现携带 ALDH2rs671 突变的个体更易发展为脓毒症 ARDS。进一步的发现 ALDH2 能够促进 PAD4 与 E3 泛素连接酶 CHIP 的结合，从而增加 PAD4 的 K48 多泛素化（调控通路），来调节 NETs 形成（关键机制）和减轻 ARDS 严重性。
使用 ALDH2 特异性激活剂 Alda-1（干预措施/临床转化）可显著改善脓毒症 ARDS，表明 ALDH2 激活可能是治疗脓毒症的有效策略。
科学问题
1、本文的关键蛋白 ALDH2 是如何得出？
其实这个问题很好回答，作者所选用的患者就是携带 ALDH2rs671 突变的个体，发现他们在脓毒症中发展为 ARDS 的风险更高。但是有些小伙伴不服气要问了，凭什么作者就选择这个突变的个体呢？其实 ALDH2rs671 是一种在亚洲人群中较为常见的基因变异，特别是在东亚人群中。这种变异导致 ALDH2 酶活性显著降低，从而可能影响个体对某些疾病的易感性。此外，ALDH2 是一种重要的酶，参与清除体内有毒醛类物质，如乙醛。
ALDH2 的活性与多种疾病的发生发展有关，包括心血管疾病、神经退行性疾病和某些类型的癌症。所以作者才考虑是否能将 ALDH2rs671 突变的个体与脓毒症结合起来。
2、作者是如何将 ARDS 同本文的机制 NETs 相联系起来的？
作者发现这些患者的血液中无细胞 DNA (cfDNA) 和髓过氧化物酶 (MPO) - DNA 复合物的水平更高，这些是 NETs) 的关键生物标志物。使用 Aldh2-/-和 Aldh2rs671 基因敲入小鼠模型，研究者在脓毒症相关模型中观察到这些小鼠表现出更严重的肺部和循环中的 NETosis。
3、作者是如何发现 PAD4 的，又是如何验证 ALDH2 对 PAD4 作用的？
其实，早已有研究报道 PAD4 通过其酶活性催化组蛋白的瓜氨酸化，这是 NETosis 发生的关键步骤。因此，研究者假设 ALDH2 可能通过影响 PAD4 的稳定性来调节 NETosis。免疫共沉淀（Co-IP）实验，也证实了 ALDH2 能够促进 PAD4 与 E3 泛素连接酶 CHIP 的结合，从而增加 PAD4 的 K48 多泛素化，导致 PAD4 通过泛素-蛋白酶途径的降解。
在 Aldh2-/-和 Aldh2rs671 基因敲入小鼠模型中也观察到 PAD4 蛋白水平的增加，以及 NETosis 的增强，这与 ALDH2 缺失或功能降低相关。进一步通过过表达 ALDH2 或使用 ALDH2 激活剂 Alda-1 处理，研究者观察到 PAD4 蛋白水平的降低和 NETosis 的抑制。
4、作者最后是如何回归临床，让研究变得更具临床转化价值的？
使用 ALDH2 特异性激活剂 Alda-1 在动物模型中进行干预实验，发现 Alda-1 能够显著改善脓毒症引起的 ARDS 症状，这为临床治疗提供了潜在的药物候选。这一发现揭示了 ALDH2 通过促进 PAD4 的多泛素化和降解来抑制 NETosis 的分子机制，这为开发针对特定分子靶点的药物提供了理论基础。
关键实验技术
使用 Aldh2-/-和 Aldh2rs671 基因敲入小鼠模型来研究 ALDH2 在脓毒症引起的 ARDS 中的作用。
利用 Co-IP 和 Western blot 研究 ALDH2 与 PAD4 及 CHIP 之间的相互作用及其对 PAD4 蛋白稳定性的影响。
使用免疫荧光和免疫组织化学检测和定位肺组织中的 NETs 标志物，如瓜氨酸化的组蛋白 H3（H3Cit）。
利用表面等离子共振（SPR）研究 ALDH2 与 CHIP 之间的直接相互作用。
研究亮点
1、为亚洲人群易发突变 ALDH2rs671 添加新的机制解释
研究发现携带 ALDH2rs671 突变的个体更容易发展为脓毒症 ARDS，这强调了 ALDH2 在疾病易感性中的作用。通过使用 ALDH2 特异性激活剂 Alda-1，研究者能够显著改善脓毒症小鼠模型中的 ARDS 症状，这为开发新的治疗策略提供了潜在的药物靶点。
2、为 NETosis 过程中的关键蛋白 PAD4 调控添新机制
研究者发现 ALDH2 通过促进 PAD4 与 E3 泛素连接酶 CHIP 的结合，增加 PAD4 的 K48 多泛素化和降解，从而抑制 NETosis。这一发现揭示了 ALDH2 在调控 NETs 形成中的分子机制，为理解 ALDH2 在炎症和免疫反应中的功能提供了新的视角。
思路拓展
其实，有关 NET 的研究近些年越发得到大家的重视，同样的在和大家分享一篇讲述有关 NET 的文章。
这篇文章中，作者首先发现 IGF2BP3 在胶质瘤中的表达与浸润性中性粒细胞的增多有显著的正相关性，通过体外共培养模型，作者观察到胶质瘤细胞与中性粒细胞共培养时，能够诱导中性粒细胞形成 NETs。进一步的实验显示，IGF2BP3 的过表达可以增强胶质瘤细胞诱导的 NETs 形成，而 IGF2BP3 的敲低则减少了 NETs 的形成。（通过关注中性粒细胞引出 NETs，而上文是通过在血液中检测到 NETs 关键的生物标志物引出的，可以说是有异曲同工之妙。）
随后，作者通过 mRNA 测序和蛋白质组学分析，发现 IGF2BP3（关键分子）通过 m6A 修饰影响 CSF3（集落刺激因子 3）的表达，进而调控 NETs 的形成。通过使用 CSF3 的中和抗体或重组蛋白（上文用的是激活剂，而这里选择的是抑制剂/抗体），作者验证了 CSF3 在 IGF2BP3 诱导的 NETs 形成中的作用。在体外实验中，作者通过免疫荧光染色和电子显微镜观察到 IGF2BP3 诱导的 NETs 形成。
在体内实验中，通过在小鼠模型中敲低 IGF2BP3 或给予 BET 抑制剂（能够抑制 IGF2BP3 表达），作者观察到肿瘤生长的抑制和 NETs 形成的减少。本文结果揭示了 IGF2BP3 在 NETs 形成中的作用，还展示了靶向 NETs 可能成为一种克服溶瘤病毒治疗抵抗的策略。
本文及图片来源于小张聊科研，作者转载
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