中文摘要
目的建立检测重组戊型肝炎疫苗宿主DNA残留量的荧光染色法,并进行方法验证。
方法采用λDNA作为标准品建立标准曲线,重组戊型肝炎疫苗纯化后原液作为样品,进行线性、准确度以及精密度的验证。
结果该方法在1.250~80.000 ng/ml范围内有良好的线性,决定系数大于0.99;准确性验证中DNA残留量加标回收率在90.00%~110.00%之间,且加标回收率相对标准偏差均小于15.00%。重复性验证和中间精密度验证的相对标准偏差分别为6.62%和10.30%,均小于15.00%。
结论该方法快速、灵敏、准确,可以检测重组戊型肝炎疫苗宿主DNA残留量。
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正文
戊型肝炎(戊肝)病毒为单股正链RNA病毒,主要通过粪-口途径传播,可引起戊肝。全球每年约发生2 000万例戊肝病毒感染,其中约330万戊肝病例,7万例与戊肝病毒感染相关的死亡病例。我国属于戊肝高发国家,近年来戊肝已成为急性病毒性肝炎的常见类型之一,发病人数已超过甲型肝炎,戊肝疫苗(hepatitis E vaccine,HepEV)的研发显得尤其重要。
近年来,随着基因工程技术的发展,基因重组疫苗的研发已愈发成熟,大肠埃希菌、酵母以及哺乳动物细胞等都已成为重组蛋白疫苗的宿主细胞。兰州生物制品研究所有限责任公司(兰州公司)第四研究室研发的HepEV由重组大肠埃希菌表达的病毒抗原经纯化冻干后制成,尽管经过多步纯化去除杂质,但宿主细胞大肠埃希菌的DNA仍有微量残留。不同宿主细胞DNA进入人体后可造成多种多样的后果,如致癌性和感染性。考虑到宿主细胞残留DNA的潜在安全风险,建立残留DNA定量测定方法并对其进行方法学的验证十分重要。本研究拟选用荧光染色法对HepEV原液中残余宿主DNA的含量进行定量测定。特异性荧光染料PicoGreen与双链DNA结合成的复合物在480 nm波长激发下产生荧光信号,检测波长在520 nm。由于一定DNA浓度范围内荧光强度与DNA浓度成正比,因此可根据荧光信号强度计算重组HepEV供试品中的DNA残留量。同时,根据中国药典2020年版三部(药典三部)中分析方法验证指导原则对建立的残余DNA定量方法进行方法学验证。
1
材料与方法
1.1
供试品
重组HepEV吸附前原液,由兰州公司第四研究室制备。
1.2
主要试剂及仪器
Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA试剂盒购自美国英杰生命技术有限公司,黑色酶标板购自美国康宁公司;酶标仪购自美国美谷分子仪器有限公司。
1.3
方法建立
将20×三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸〔tris(hydroxymethyl) aminomethane-ethylenediamine-tetraacetic acid,TE〕用灭菌注射水稀释为1×TE缓冲液。用稀释好的TE缓冲液将DNA标准品配成80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500及1.250 ng/ml的标准品溶液。将DNA标准品溶液和供试品溶液加至黑色96孔酶标板中,每孔100 μl,做3个复孔。用TE缓冲液200倍稀释双链DNA荧光染料,然后于黑色96孔酶标板中加入稀释的荧光染料,每孔100 μl。避光操作,混匀后于室温静置5 min。用酶标仪在激发波长480 nm、发射波长520 nm处测定荧光强度,读值在5 min内完成。以1×TE缓冲液测得的荧光强度为本底,测定标准品溶液和供试品溶液的荧光值。以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归,求得直线回归方程。将供试品溶液的荧光强度代入直线回归方程即求得供试品DNA浓度。
1.4
方法验证
1.4.1 线性关系用稀释好的TE缓冲液将λDNA标准品配制成80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500及1.250 ng/ml的标准品溶液,每个浓度各6份。以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归,得出线性决定系数(R2)。
1.4.2 准确度考察不同浓度的供试品在加标量低、中、高3种不同浓度水平下的回收率。取不同浓度的3份供试品溶液按1∶1比例各加入3种不同浓度的标准品,共制备9份供试品,高、中、低理论加标浓度分别为40.000、20.000以及10.000 ng/ml。每份供试品做3个复孔,结果取均值。根据标准曲线计算实际浓度,计算样品加标回收率。回收率=(实测值﹣供试品中被测成分量)÷加入标准品量×100%。
1.4.3 精密度
1.4.3.1 重复性将供试品重复检测6次,计算6次残留DNA结果及其相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。HepEV吸附前原液宿主细胞DNA残留量(ng/μg)=吸附前原液宿主细胞残留DNA浓度(ng/ml)÷吸附前原液的蛋白浓度(μg/ml),其残留DNA浓度的质量标准为不超过0.1 ng/μg。每剂HepEV的DNA残留量(ng)=吸附前原液宿主细胞残留DNA浓度(ng/μg)×每剂抗原含量(μg)。
1.4.3.2 中间精密度考察不同分析人员、不同日期对精密度的影响。取供试品6份,3 d内由2人测定DNA残留量,每次测定2份供试品,同时每份供试品做3个复孔,结果取3个复孔的均值。结合6份供试品残留量试验数据,计算6次结果的RSD。
2
结果
2.1
线性关系
线性验证共制备6份不同浓度的标准品溶液绘制标准曲线,共进行6次检测。以标准品溶液的浓度为纵坐标,荧光强度值为横坐标作线性回归。由表1可知,标准品溶液在1.250~80.000 ng/ml范围内有良好的线性关系,R2均>0.99。
2.2
准确度
供试品的加标回收率见表2,供试品加标10.000、20.000、40.000 ng/ml的回收率均在90.00%~110.00%之间,且加标回收率RSD均小于15.00%,表明该方法准确度符合要求。
2.3
精密度
2.3.1 重复性将供试品重复测定6次后,测试结果平均残留DNA浓度为0.019 ng/μg,重复性RSD为6.62%(表3),所有结果均符合质量标准(≤0.1 ng/μg)。
2.3.2 中间精密度由表4可知,不同人员和不同时间测量的供试品DNA残留量均符合质量标准,均值为0.018 ng/μg,RSD为10.30%,表明本方法中间精密度检测符合要求。
3
生物制品在生产过程中,尽管经过下游工艺去除了大量的宿主细胞DNA,但是仍有微量的DNA残留,导致有致癌和感染的风险。为了保证生物制品的安全性,各监管机构对生物制品中的残留外源DNA制定了严格的标准。药典三部规定,以中国仓鼠卵巢细胞生产的生物制剂中DNA残留量不能超过10 pg/剂,以真菌和细菌生产的疫苗中DNA残留量不能超过10 ng/剂。如今,宿主细胞残留DNA已作为生物制品安全性评价的重要指标,药典三部中介绍了3种外源性DNA残留量测定的方法:DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法。
本研究中建立了检测重组HepEV残余宿主DNA荧光染色法,并对建立的方法进行了线性、准确性以及精密度的验证。由验证结果可知残余DNA含量线性R2均>0.99;准确性验证高中低浓度的加标回收率均在90.00%~110.00%范围内;重复性和中间精密度RSD均在<15.00%的可接受范围内,表明该方法线性良好、准确性和精密度高,可用于检测重组HepEV残余DNA的含量。荧光染色法同DNA探针法相比,不受工程菌种类限制,且简便、快速;与定量PCR法相比,其操作简单,耗时短,也不需要设计特异性引物。
需要注意的是,由于荧光染色法荧光信号易受干扰,特异性较差,因此所有使用的材料和试剂都必须不含DNA,避免环境DNA污染。
作者
张巧玲1 张志豪2 秦海艳1 杨林鹏1 杨俊杰1
1兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室, 兰州 730030;2兰州生物制品研究所有限责任公司中试研究室, 兰州 730030
通信作者:杨俊杰,
Email:jjyang@vacmic.com
引用本文:张巧玲, 张志豪, 秦海艳, 等.重组戊型肝炎疫苗宿主细胞残余DNA荧光染色法检测方法的建立和验证[J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 203-206.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240105-00002
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撰写| 国际生物制品学杂志
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Alice
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