染色质结构域在胚胎发育和各种疾病的进展中起着至关重要的作用。染色质结构域异常可导致异常基因表达或沉默，导致癌症发展和转移。事实上，调节染色质结构域的核机制成分是人类癌症中最常发生突变的基因。因此，对染色质结构域的全面分析对于理解正常发育和疾病发病机制中涉及的基因调控程序至关重要。然而，由于染色质动力学的复杂性和技术限制，分析原发组织和肿瘤活检中的染色质结构域面临着独特的挑战。目前用于分析染色质结构的方法不容易扩展到异质组织，解决这一挑战需要开发更敏感的单细胞染色质结构分析方法和先进的数据分析计算工具。
近日，美国加州大学圣地亚哥分校的任兵团队在Nature Biotechnology发表了题为“Droplet Hi-C enables scalable, single-cell profiling of chromatin architecture in heterogeneous tissues”的文章。研究团队介绍了一种高度可扩展的、基于液滴的单细胞Hi-C方法——Droplet Hi-C，它可使用商业微流体装置在液滴中进行高通量单细胞染色质构象分析。研究团队使用Droplet Hi-C绘制了小鼠皮质的染色质结构图，并分析了主要皮质细胞类型中的基因调控程序。此外，研究团队还使用Droplet Hi-C检测了人类胶质母细胞瘤、结直肠癌和血液癌症细胞的拷贝数变化、结构变异和染色体外DNA（ecDNA），揭示了治疗过程中的克隆动力学和其他致癌事件。经过改进后，这项技术可以对单细胞中的染色质结构和转录组进行联合分析，有利于对正常组织和肿瘤中染色质结构与基因表达之间的联系进行探索。
文章发表在Nature Biotechnology
1.Droplet Hi-C的开发
Droplet Hi-C基于原位Hi-C流程，通过限制性消化和原位连接，捕获甲醛交联细胞或细胞核中染色质纤维之间的全基因组空间邻近性（图1a）。从经固定的细胞或细胞核到最终的测序文库，整个流程持续约10小时，可并行处理8个样本，同时分析超4万个细胞（图1a-c），是迄今为止实验耗时最短、实操时间最短的单细胞Hi-C方法（图1b）。鉴于商业微流体系统的广泛使用、实验程序的简易性和相对较低的成本（图1c），Droplet Hi-C具有广阔的应用潜力。
为了测试Droplet Hi-C的性能，研究团队将其应用于人HeLa S3细胞系和小鼠胚胎干细胞（mESC）细胞系混合物、三种人类细胞系（K562、GM12878和HeLa S3）混合物、二倍体细胞（GM12878和WTC-11）混合物，结果显示Droplet Hi-C可以准确区分细胞类型特异性染色质结构域。
图1. Droplet Hi-C的概述和性能。
2.Droplet Hi-C揭示小鼠皮质的染色质结构
为了证明将Droplet Hi-C应用于原发组织的可行性，研究人员使用8周龄小鼠的皮质组织，生成了6235个高质量单细胞染色质图谱。将Droplet Hi-C小鼠皮质数据与Dip-C36和sn-m3C-seq37的数据进行比较后发现，接触概率随距离、染色质区室和拓扑关联结构域（TAD）边界的衰减显示了一致的模式。简言之，Droplet Hi-C可以可靠、稳健地检测复杂组织中的染色质结构。
为了系统地探讨不同细胞类型染色质结构的差异，并阐明它们与染色质状态和基因表达的关系，研究人员首先以100kb的分辨率分析了A和B区室的差异。区室分数与转录活性相关，895个基因组区域显示了与染色质状态相关的可变区室分数（图2a，b）。跨细胞类型表达变异较高的基因更有可能与可变TAD边界相关（图2d，e）。这些发现表明，Droplet Hi-C能够稳健地分析复杂组织中的染色质结构和细胞类型特异性基因调控。
图2. 成年小鼠皮质中不同细胞类型的染色质区室、TAD、环和染色质中心的比较分析。
3.Droplet Hi-C检测癌症细胞染色体变异
作为概念验证，研究人员将Droplet Hi-C应用于两种结直肠癌细胞系（COLO320DM和COLO320HSR），这两种细胞系都携带相似的MYC扩增子拷贝。在COLO320DM中，MYC基因存在于染色体外DNA（ecDNA）上；在COLO320HSR中，MYC是均匀染色区（HSR）的一部分。正如预期，在两种细胞系中都发现了MYC基因座的拷贝数升高（图3a）。通过使用推断的DNA拷贝数来纠正接触矩阵中的偏差，研究人员在这些细胞系中发现了不同的结构变异，包括chr6上的重复（图3b）。
研究人员还推断了MYC拷贝数（图3f），并分析了反式与顺式接触比（图3g），均显示COLO320DM和COLO320HSR之间存在显著差异（图3f，g）。COLO320DM的MYC拷贝数比COLO320HSR多约47%，与之前的报告（图3f）一致，反式与顺式接触比也更高（图3g）。这些发现表明，ecDNA和HSR在单个细胞和跨细胞群中显示出不同的染色体相互作用模式，进一步支持单细胞Hi-C数据可用于区分ecDNA和HSR。
图3. Droplet Hi-C检测癌症细胞系中的结构变异和ecDNA。
4.Droplet Hi-C揭示ecDNA的异质性和进化
先前的研究表明，携带表皮生长因子受体（EGFRvIII）染色体外致癌变异的胶质母细胞瘤（GBM）细胞在用酪氨酸激酶抑制剂如厄洛替尼治疗后会产生耐药性。为了进一步表征耐药性获得过程中EGFR ecDNA丰度和异质性的动态，研究人员使用Droplet Hi-C分析了未经治疗的GBM39细胞和经过30天以上厄洛替尼治疗的GBM39-ER细胞（图4a）。根据染色质结构解析了五个不同的细胞簇（图4b），发现厄洛替尼治疗后，GBM39细胞中观察到显著的进化转变，细胞亚群发生显著变化（图4b-d）。研究人员推断，厄洛替尼治疗可能诱导形成含有不同ecMYC的独特细胞群，而不是在治疗后选择性地富集含有ecMYC且具有生长优势的先前存在的细胞群。
图4. Droplet Hi-C揭示了药物治疗前后胶质母细胞瘤细胞系中ecDNA的异质性和进化。
5.Droplet Hi-C检测原发性肿瘤样本的异质性
ecDNA不仅是预后不良的生物标志物，也是胶质母细胞瘤的关键驱动因素。研究人员进一步将Droplet Hi-C应用于异柠檬酸脱氢酶野生型GBM肿瘤样本（图5a），根据染色质结构对细胞进行聚类，并将恶性细胞与非恶性细胞分离（图5b）。在恶性细胞中检测到预期的染色体畸变，如chr10的缺失和chr7的扩增（图5c），以及根据染色质接触模式和拷贝数变异鉴定为ecDNA样的EGFR基因位点（图5c–e）。总之，Droplet Hi-C有效地检测了原发胶质母细胞瘤样本中恶性细胞特有的拷贝数变异、ecDNA、结构变异和染色质结构。
图5. Droplet Hi-C揭示了原发性胶质母细胞瘤样本中的肿瘤内异质性和ecDNA。
6.染色质结构和转录组的联合分析
染色质结构域和转录组的单细胞联合分析有助于分析基因表达和染色质结构之间的关系。研究人员优化了Droplet Hi-C方案，使其与10x Genomics的Chromium单细胞多组试剂盒一起工作，创建了Paired Hi-C，可同时分析来自同一个细胞核的RNA和Hi-C（图6a）。总之，Paired Hi-C可以直接将染色质重组和结构改变（如ecDNA）与基因表达联系起来，为发育和疾病中的基因调控机制提供了有价值的见解，特别是在了解肿瘤进展和耐药性方面。
图6. 用Paired Hi-C联合分析单细胞染色质结构和转录组。
结语
综上所述，该研究开发了一种高可扩展性的单细胞Droplet Hi-C方法，使用市售微流控平台提供高通量单细胞Hi-C测定，操作时间最少，成本更低，在解析小鼠大脑等复杂组织中细胞类型特异性染色质结构方面的实用性也进行了验证。Droplet Hi-C可用于识别癌症细胞中的结构变异和染色质结构，从而阐明驱动肿瘤进展和耐药性的调控程序，为理解肿瘤演变和治疗反应提供了巨大的潜力。Droplet Hi-C还以单细胞分辨率绘制了ecDNA在肿瘤细胞中的染色质相互作用组。总之，Droplet Hi-C既解决了异质组织染色质分析中的关键空白，又增强了我们对基因调控的理解。
论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41587-024-02447-1
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