FSHW | 漆酶/咖啡酸催化的交联偶联半乳甘露聚糖改变卵清蛋白的构象结构，减轻Th2介导的过敏性哮喘|介导|偶联|半乳甘露|卵清蛋白|咖啡酸|过敏性哮喘

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Abstract

卵清蛋白（OVA）是主要的致敏蛋白，可诱导辅助性T-2（Th2）过敏反应，目前的治疗方案尚不充分。在这项研究中，通过漆酶/咖啡酸（Lac/CA）催化与半乳甘露聚糖（Man）的交联，开发了一种低过敏性的聚合OVA产品。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blotting分析高分子量交联聚合物的形成和IgG的结合。研究表明，Lac/CA催化的交联＋Man偶联极大地改变了OVA的二级和三级结构，并改变了OVA的表面疏水性。胃肠消化稳定性试验表明，交联OVA在模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）中表现出较小的抗性。小鼠模型研究表明，Lac-Man/OVA改善了嗜酸性气道炎症反应，有效下调Th-2相关细胞因子（白细胞介素（IL）-4、IL-5和IL-13）的表达，上调IFN-γ和IL-10的表达。用Lac-Man/OVA刺激骨髓源性树突状细胞可抑制表型成熟标志物（CD80和CD86）和MHC II类分子的表达，抑制炎性因子的表达水平。本研究获得的知识为获得低过敏性OVA产品提供了有效途径，该产品可以缓解OVA诱导的过敏性哮喘的治疗效果。

Introduction

食物引起的过敏性疾病是生活在高度发达社会的人们最具压迫性的疾病，可以在哮喘、皮炎、鼻炎、结膜炎中看到，在某些情况下，还可以在过敏反应中看到。食物过敏是由食用特定食物引发的一种异常的免疫反应，如鸡蛋、牛奶、鱼、贝类、花生、树坚果和大豆。摄入食物后，过敏原特异性免疫球蛋白E（IgE）与其高亲和力的IgE受体（FcεRI）与致敏肥大细胞或嗜碱性细胞相互作用，引起T-辅助性（Th）1/Th2细胞因子失衡，释放促炎介质或细胞因子，从而引发过敏反应。Th-2型细胞因子（白细胞介素（IL）-4、IL-5和IL-13）可通过诱导气道高反应性发展、肺嗜酸性粒细胞浸润和气道粘液分泌而引起哮喘综合征。鸡蛋和蛋制品被认为是在过敏人群中最常见的可引起过敏反应的食物。目前，鸡蛋过敏在成人中的患病率为1%～2%，在一岁以下儿童中高达9.5%。卵清蛋白（OVA）是在鸡蛋中发现的主要致敏蛋白，分子量（MW）为45 kDa。OVA可引起致敏个体的过敏反应，可用于哮喘模型食物过敏的实验诱导。

近年来，研究者致力于通过热加工、糖基化、静水高压、辐照等多种物理和化学处理方法，降低致敏蛋白的免疫反应电位，开发低致敏性或低致敏性蛋制品。低致敏性产品也可以作为免疫治疗的候选药物，因为它们的安全性比未经修饰的过敏原更快、更简单地给药。在最近的过去，酶交联技术被用来减轻食物蛋白质的致敏性，通过分子内或分子间共价键合并蛋白质分子，导致交联的高分子量过敏原聚合物。酶交联有可能改变蛋白质的构象结构、结合表位、功能特性、电荷部分和分子量，并随后导致抗原性和IgE结合电位的降低。

漆酶（Lac）通过单电子去除机制催化酪氨酸侧链氧化，显示出作为一种新型交联剂的前景。这导致不稳定的芳香族自由基的形成，与蛋白质反应，产生交联产物。蛋白质中的酚类部分主要作为Lac介导氧化的底物暴露，由此产生的苯氧自由基可能同时与氨基反应，引发进一步的交联反应。多酚与OVA之间的相互作用可以通过改变结构特性和降低过敏原的生物可利用性来降低过敏原的致敏性。此外，据报道，咖啡酸（CA）是一种多酚化合物，通过提供羟基官能团来增强Lac的交联效果，羟基官能团在克服靶蛋白表面暴露的酪氨酸残基缺失方面发挥部分作用。

有研究报道，卵细胞与甘露糖结合可减轻小鼠口服诱导的鸡蛋过敏。抗原与甘露聚糖结合确实会触发树突状细胞（DCs）成熟程度降低，随后通过降低T细胞活化在下游细胞因子和IgE的产生中发挥重要作用。有证据表明，OVA的甘露糖基化有可能通过影响DC成熟和抗原识别来减少小鼠的过敏。靶向DCs是一种很有前景的治疗选择，它通过产生过敏原特异性Treg细胞来诱导外周T细胞耐受，维持免疫稳态并减轻过敏性疾病。因此，甘露糖偶联与Lac/CA催化交联可用于开发一种创新的低过敏性产品，通过塑造免疫反应，将与过敏性蛋白相关的过敏风险降至最低，从而为工业和生物医学应用提供了广阔的前景。

因此，在本研究中，开发了一种基于Lac/CA催化交联结合甘露糖偶联的低过敏性OVA衍生物，并研究了其对OVA构象结构和消化率的影响。进一步阐明交联OVA对骨髓源性DCs（BMDCs）功能和成熟的影响，观察其刺激能力的变化。使用Th-2诱导的哮喘模型进一步研究了Lac-半乳甘露聚糖（Man）/OVA是否可以改善过敏反应和嗜酸性气道炎症。

Results

Lac/CA交联OVA的电泳谱和IgG结合活性

天然OVA和交联OVA的电泳图谱如图1A所示。结果表明，单独或与Man联合使用Lac/CA-酸交联的OVA降低了天然OVA的密度（45 kDa）（图1A）。然而，单独用Man（Man-OVA）处理OVA并没有显示出任何明显的效果（图1A，Lane 2）。当用Lac/CA（Lac-OVA）处理OVA时，在100 kDa左右和180 kDa以上观察到具有优势MW的新波段（图1A，Lane 3），表明产生了高MW交联。LacOVA与Man偶联（Lac-Man/OVA）形成高分子量交联（＞180 kDa），天然OVA带强度大幅降低（图1A，Lane 4）。Western blot分析表明，交联后，45 kDa处OVA的IgG免疫反应带密度降低。此外，在Lac-Man/OVA的情况下，高分子量聚集体对IgG抗体表现出反应性（图1B，Lane 3）。而在Lac-Man/OVA的情况下，高分子量聚集体不被IgG结合识别（图1B，Lane 4），这表明结合表位发生了变化。

Lac/CA催化的Man交联改变了OVA的构象结构

在紫外吸收光谱和荧光光谱的基础上评估了蛋白质三级结构的变化。紫外吸收光谱显示，Man-OVA、Lac-OVA和Lac-Man/OVA的波长分别从277 nm（OVA）增加到273、272和276 nm（蓝移）。而与天然OVA相比，Lac-OVA和Lac-Man/OVA的最大吸光度峰增加了~1.7倍和~5倍（图1C）。与天然OVA相比，Lac-Man/OVA的荧光强度降低幅度最大（约45倍），而Man-OVA（约2.5倍）和Lac-OVA（约8.5倍）的荧光强度也有所下降（图1D）。波长从332 nm（OVA）到335 nm（Man-OVA）和336 nm（Lac-OVA和Lac-Man/OVA）红移。表面疏水性分析表明，Lac-Man/OVA的峰值荧光强度并没有明显增加，而Man-OVA和Lac-OVA的表面疏水性分别增加了约3.5倍和1.7倍（图1E）。

CD光谱分析表明，OVA的聚合导致了更复杂的结构，α-螺旋和β-折叠的强度发生了变化（图1F）。正的摩尔残留椭圆度峰表示存在β-折叠结构，而两个负峰表示存在α-螺旋结构。与其他处理的OVA相比，Lac-Man/OVA显示出最大的阳性峰和阴性峰减少，表明OVA构型的二级结构发生了实质性的改变。此外，Lac介导的交联以及Man偶联引起了粒径和zeta电位的变化。OVA、Man-OVA、Lac-OVA和Lac-Man/OVA的平均粒径分别为115、170、233.1和382.2 nm（图1G），其中Lac-Man/OVA的粒径分布增幅最大。用Lac/CA处理后zeta电位结果显示为负趋势，而与Man偶联导致zeta电位值中性（图1H）。这些结果表明，Lac/CA催化交联与Man偶联制备了高分子量聚合物，改变了OVA的构象结构。

Lac/CA催化与Man结合的交联提高了OVA的胃肠道消化率

在本研究中，进行了胃肠消化稳定性实验，观察Man和Lac/CA处理的OVA蛋白组分的变化（图2）。根据SDS-PAGE结果，天然OVA的原始条带在1小时内被胃蛋白酶轻微消化（图2A），而Man-OVA在5 min后开始消化，45 kDa处的条带在消化1 h变得非常弱（图2B）。Lac-OVA在45 kDa处的原始OVA带在消化2 min后完全消失，高分子量聚合物对胃消化表现出抗性（图2C）。Lac-Man/OVA对SGF的稳定性较弱，高分子量聚合物在15 min后完全降解（图2D）。

同样，在SIF消化期间，天然OVA对胰蛋白酶消化表现出很高的稳定性（图2E）。SIF结果表明，Man-OVA、Lac-OVA和Lac-Man/OVA表现出不同的消化模式，与消化性消化相比，稳定性较弱（图2F-H）。SIF消化2 min后，原OVA条带几乎消失，形成15～20 kDa左右的消化片段，消化1 h后密度减小。此外，Lac-Man/OVA的大分子带在2 min后完全消失（图2H），而Lac-OVA的高MW带直到30 min才被消化（图2G）。这些结果表明，随着消化期的延长，降解程度越来越明显。消化酶和胰蛋白酶消化的结果表明，Lac/CA催化的交联加Man偶联显著提高了OVA的消化率。

交联OVA可降低OVA诱导哮喘模型的细胞浸润和Th-2型细胞因子的产生

本研究建立了过敏性哮喘模型，以评估Lac/CA辅助交联结合Man对OVA诱导的过敏性炎症的潜在治疗和预防作用。与OVA组相比，相同剂量的Man-OVA、Lac-OVA和Lac-Man/OVA治疗显著降低了BALF（图3A）和肺（图3B）中的浸润细胞总数。为了了解交联OVA抑制气道炎症的机制，通过qPCR和流式细胞术检测了肺组织中细胞因子的表达。qPCR结果显示，Lac-Man/OVA显著增强了肺组织中Ifng和Il10的表达，但显著抑制了Th-2型细胞因子（Il4、Il5和Il13）的表达（图3C）。细胞内染色显示，与天然OVA组相比，交联OVA（Lac-OVA和Lac-Man/OVA）处理的小鼠肺组织中IL-4+、IL-5+和IL-13+ CD4+ T细胞的百分比较低（图3D-F），而两组中IFN-γ+ CD4+ T细胞的百分比显著较高（图3G）。综上所述，这些结果表明Lac/CA交联的OVA与Man结合通过调节Th1/Th2平衡来抑制Th2反应。

图3 在OVA诱导的小鼠哮喘模型中，Lac/CA催化的交联与Man结合减少了浸润细胞和炎症相关基因

交联OVA可减轻Th-2诱导哮喘模型的哮喘发展

BALF的流式细胞分析显示，Lac-Man/OVA显著降低了嗜酸性粒细胞总量（图4A）和中性粒细胞总量（图4B）。同样，Lac-Man/OVA显著降低了肺中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞总量（图4C和D）。与OVA组相比，Man-OVA和Lac-OVA组BALF和肺中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞计数也明显减轻（图4）。同时，肺组织切片采用H&E染色，观察气道炎症的发展情况。与阴性对照（NC）和交联OVA组相比，OVA组出现了严重的气道炎症反应（图5A）。OVA组在呼吸道和血管周围可见广泛的炎症细胞浸润。与OVA组相比，Man-OVA、Lac-OVA和Lac-Man/OVA组气道炎症均有明显改善。交联OVA注入小鼠后，经PAS染色发现肺内黏液的产生明显减少，而OVA组显示杯状细胞粘液分泌增加（图5B）。总之，这些结果表明OVA与Lac交联并Man偶联在小鼠变应性炎症模型中具有最高的治疗和预防作用。

交联OVA调节脂多糖诱导的BMDCs成熟和抑制促炎细胞因子的产生

本研究推测Lac-Man/OVA可能通过影响DC成熟模式和功能调节T细胞的分化途径。因此，接下来确定了Lac-Man/OVA对BMDCs功能和成熟的影响。与LPS和LPS＋OVA活化的BMDCs相比，Lac-Man/OVA处理的BMDCs的共刺激分子（CD80和CD86）和MHC II的表达显著降低（图6A）。接下来，研究了Lac-Man/OVA对BMDCs细胞因子产生的影响。研究结果显示，Lac-Man/OVA刺激BMDCs显著抑制了Il1b和Il6的mRNA表达（图6B和C）。此外，在Lac-Man/OVA刺激的BMDCs中，Tnfa的表达没有改变（图6D），而Il10的表达升高（图6E）。这些结果表明，Lac/CA催化的交联结合Man偶联改变了OVA的免疫刺激潜能，从而调节了DC的成熟和功能。

图6 Lac/CA交联结合Man可调节LPS诱导的骨髓DCs的成熟和功能

Discussion

Lac介导的交联有可能改变致敏蛋白的功能和结构特性，这取决于交联形成的类型和程度。先前的研究表明，用Lac和CA处理过敏原蛋白会导致高分子量聚合蛋白的产生，从而导致天然蛋白带的密度降低。Lac/CA交联对IgG结合潜力的识别降低可能是由于结构完整性的改变，从而影响了过敏原的结合表位。目前的研究结果与许多关于交联膳食蛋白诱导聚合物形成的报道一致，这进一步降低了潜在的抗原性。

紫外吸收光谱和本征荧光光谱结果表明，Lac/CA和Man处理后构象结构发生了变化。蛋白质的荧光光谱和紫外吸收是由含有色氨酸和酪氨酸残基的芳香侧链基决定的。光谱强度的变化表明，由于聚集和交联形成，特定氨基酸残基发生了修饰。酶交联后表面疏水性的增加揭示了OVA三维结构的改变，这可能归因于酶与蛋白质疏水性基团的相互作用以及过敏原的部分展开。与Man偶联进一步影响了卵细胞的结构性质，这可能是由于美拉德反应和酶糖基化。这两种方法都是很有希望的掩盖食物蛋白过敏原的方法。CA的加入可能通过提供额外的羟基官能团在蛋白质中诱导非二硫共价键，从而进一步提高酶的交联效率。本研究结果表明，Lac/CA催化的交联结合Man偶联极大地改变了OVA的构象结构。

考虑到食物在摄入后通常在人体消化系统中停留的时间，评估了不同时间点SGF和SIF中天然OVA和交联OVA的消化率。在Lac/CA催化交联后，OVA的消化稳定性和免疫反应性在SGF和SIF中均显著降低。胃蛋白酶对于苯丙氨酸和酪氨酸残基具有裂解特异性，而胰蛋白酶对精氨酸和赖氨酸残基表现出更高的特异性。天然OVA和交联OVA在消化酶和胰蛋白酶消化过程中消化模式的差异可能是由于蛋白酶和胰蛋白酶对肽键的切割特异性不同。Lac/CA和Man处理引起OVA构象结构的改变，这可能使某些氨基酸残基暴露于这些蛋白酶的裂解中。本研究结果与先前的报道一致，即交联过敏原蛋白的消化比天然过敏原要快得多。

过敏性疾病主要是由以Th2表型为主的抗原特异性免疫反应引起的，该免疫反应可产生大量的细胞因子。在这项研究中，首次评估了一种新型低过敏性Lac/CA交联加Man偶联OVA对改善OVA诱导的哮喘发病机制的治疗潜力。与天然OVA组相比，Lac-Man/OVA显著下调肺中Th2型细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）。这些细胞因子可诱发哮喘综合征，包括B细胞产生IgE、气道高反应性发展、肺嗜酸性粒细胞浸润和气道粘液分泌。此外，与天然OVA相比，Lac-Man/OVA上调了Th1（IFN-γ）和Treg（IL-10）细胞因子。Th1和Treg细胞通过下调Th2细胞，抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞的激活，在预防过敏反应的发生中发挥重要作用。因此，观察结果表明，Lac-Man/OVA促进IL-10和IFN-γ的产生，可能在Th-2介导的过敏性哮喘模型中诱导免疫抑制功能。交联OVA缓解过敏性哮喘的作用可能是由于LacCA催化交联与Man偶联后OVA结合表位发生改变。

基于上述信息，抑制Th-2偏倚免疫的治疗策略可能会导致过敏性哮喘的管理。交联OVA对气道炎症和气道重塑有较强的预防作用。组织病理学结果显示肺泡间隙保留，支气管壁薄，炎症细胞浸润减少。在本研究中，病理症状（包括嗜酸性粒细胞浸润、粘液分泌和气道炎症）诱导的减少可能归因于Th-2型细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）的下调。

在过敏性哮喘中，IL-4、IL-5和IL-13主要参与炎症表型的发展，临床控制不良与肺泡Th2反应有关。IL-5通常被认为是刺激嗜酸性粒细胞分化、成熟、激活和募集的关键。而IL-13在诱导气道高反应性、嗜酸性粒细胞浸润和气道粘液分泌方面的作用更强。此外，IL-10通过抑制效应T细胞增殖和细胞因子的产生、减少IgE的产生、抑制气道嗜酸性粒细胞增多和下调促炎细胞因子的释放，在免疫耐受、预防炎症和免疫病理中发挥关键作用。这解释了由Lac-Man/OVA介导的良好的体内平衡和平衡的免疫调节，这是导致健康免疫反应发展的关键事件。总之，研究结果表明，Lac-Man/OVA通过抑制气道嗜酸性粒细胞和炎症来抑制效应Th2细胞的反应，从而限制OVA诱导的过敏性哮喘。

树突状细胞是关键的抗原提呈细胞，它决定了对吸入抗原的反应是否会通过细胞因子产生过敏性炎症或免疫耐受。本研究证实，Lac-Man/OVA通过改变细胞表面分子表达和调节细胞因子的产生来改变DCs的成熟标志物。重要的是，这是第一个提供证据的研究，证明交联OVA处理和LPS刺激的DC可以降低促炎细胞因子（即IL-6）的水平，并产生相对较高的IL-10。IL-10是一种主要的免疫抑制细胞因子，可下调DC上MHC II的表达，抑制DC分泌IL-12。与表达高水平MHC II、CD80和CD86以及大量促炎细胞因子的完全成熟的DC相比，Lac-Man/OVA处理的DC更接近于部分成熟的DC。事实上，部分成熟的产生IL-10的DC的抗原呈递已被证明通过形成产生IL-10的Treg细胞来诱导耐受性，从而保护宿主免受过敏。基于这些结果，提出Lac-Man/OVA可能通过抑制DC成熟来抑制效应T细胞反应。据报道，Man治疗引起的OVA构象结构的变化调节了DC功能和成熟。这证实了结构确实在影响抗原的致敏潜能方面发挥作用，从而表明了结构-功能关系。总之，Lac/催化的OVA交联结合Man偶联可能通过改变OVA的过敏效力来预防过敏反应。

Conclusion

综上所述，Lac/CA催化的OVA交联和Man偶联导致了高分子量聚合物的形成，并改变了OVA的构象结构。胃肠消化稳定性结果显示，交联OVA对消化酶和胰蛋白酶消化更敏感，而天然OVA则表现出较高的抵抗力。此外，Lac-Man/OVA抑制气道炎症，下调Th-2相关细胞因子的表达，上调Th1细胞因子和IL-10的表达，从而正向调节Th1和Th2的免疫平衡，从而诱导向非过敏反应转变。本研究结果表明，通过这种方法修饰OVA可以有效地调节DC成熟并抑制促炎细胞因子的产生。本研究提示，利用该方法合理设计低致敏性OVA产品，为缓解OVA诱导的过敏性炎症提供了一种有效、安全的免疫治疗候选药物。

Laccase/caffeic acid-catalyzed crosslinking coupled with galactomannan alters the conformational structure of ovalbumin and alleviates Th2-mediated allergic asthma

Ishfaq Ahmeda,b, Suidong Ouyanga, Shengquan Wua,c, Haochang Songa,c, Miaoyuan Zhanga,c, Renxing Luoa,c, Peishan Lua,c, Jiaqi Denga,c, Tingting Zhenga, Yanyan Wanga, Xinguang Liua, Gonghua Huanga,*

a Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics, The First Dongguan Affiliated Hospital, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, China

b Haide College, Ocean University of China, Laoshan Campus, Qingdao 266100, China

c School of Medical Technology, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, China

*Corresponding author.

Abstract

Ovalbumin (OVA) is the major allergenic protein that can induce T helper 2 (Th2)-allergic reactions, for which current treatment options are inadequate. In this study, we developed a polymerized hypoallergenic OVA product via laccase/caffeic acid (Lac/CA)-catalyzed crosslinking in conjunction with galactomannan (Man). The formation of high molecular weight crosslinked polymers and the IgG-binding were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting. The study indicated that Lac/CA-catalyzed crosslinking plus Man conjugation substantially altered secondary and tertiary structures of OVA along with the variation in surface hydrophobicity. Gastrointestinal digestion stability assay indicated that crosslinked OVA exhibited less resistance in simulated gastric fl uid (SGF) and simulated intestinal fluid (SIF). Mouse model study indicated that Lac-Man/OVA ameliorated eosinophilic airway inflammatory response and efficiently downregulated the expression of Th2-related cytokines (interleukin (IL)-4, IL-5, and IL-13), and upregulated IFN-γ and IL-10 expression. Stimulation of bone marrow-derived dendritic cells with Lac-Man/OVA suppressed the expression of phenotypic maturation markers (CD80 and CD86) and MHC class Ⅱ molecules, and suppressed the expression levels of proinfl ammatory cytokines. The knowledge obtained in the present study offers an effective way to acquire a hypoallergenic OVA product that can have a therapeutic effect in alleviating OVA-induced allergic asthma.

Reference:

AHMED I, OUYANG S D, WU S Q, et al. Laccase/caffeic acid-catalyzed crosslinking coupled with galactomannan alters the conformational structure of ovalbumin and alleviates Th2-mediated allergic asthma[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 1962-1973. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250163.