本文系Food Science and Human Wellness原创编译，欢迎分享，转载请授权。

Abstract

采用高通量测序技术和气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）技术，对不同加工年份（第1、2、3年样品）诺邓火腿内部微生物多样性和小分子代谢产物进行分析，研究微生物和小分子代谢产物对不同加工年份火腿品质的影响。结果表明，不同加工年限诺邓火腿的优势菌门为变形菌门和厚壁菌门，优势真菌门为子囊菌门和担子菌门，优势菌为葡萄球菌，优势真菌为曲霉菌。从不同加工年份的诺邓火腿中共鉴定出252种小分子代谢产物，通过多元统计分析筛选出12种不同的代谢产物。进一步的代谢途径分析表明，有23条代谢途径与火腿发酵有关，其中8条代谢途径对火腿发酵有显著影响。L-脯氨酸、苯乳酸、L-赖氨酸、肌肽、牛磺酸、D-脯氨酸、甜菜碱和肌酸的含量与葡萄球菌属和沙雷氏菌属的相对丰度呈显著正相关，与盐单胞菌属、曲霉属和墨西哥山田氏酵母的相对丰度呈显著负相关。

Introduction

干腌火腿是一种传统的天然发酵肉制品。世界上著名的干腌火腿有西班牙的伊比利亚火腿、意大利的帕尔马火腿、美国的乡村火腿、德国的威斯特伐利亚火腿、中国的宣威火腿等。它因其丰富的营养和独特的风味而受到世界各地消费者的欢迎。干腌火腿在加工过程中，原料火腿受到微生物和内源酶的影响，导致火腿中的蛋白质、碳水化合物和脂质分解，影响干腌火腿的品质和风味。此外，微生物的种类也会影响火腿的风味特征。因此，了解干腌火腿中微生物群落组成是成功调控和提高干腌火腿品质的关键。金华火腿不同发酵阶段的细菌多样性和微生物群落结构存在显著差异。

近年来，代谢组学已被应用于肉类研究的各个方面，包括评价肉类的安全性和研究影响肉类品质的因素。在利用代谢组学分析了干腌火腿中的挥发性风味物质后，鉴定出6个不同加工阶段的407种挥发性风味物质，其中含量最丰富的是醇类和醛类。采用代谢组学方法研究金华火腿、宣威火腿、美国乡村火腿、巴马火腿和帕尔玛火腿的风味成分，区分了不同类型的干腌火腿。通过代谢组学分析发现，在去骨干腌火腿加工过程中，大部分代谢产物的含量呈上升趋势，其中异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、甲酸盐和次黄嘌呤是去骨干腌火腿的主要风味物质。

目前，对不同加工年限诺邓火腿品质特性的研究较少，特别是对其微生物多样性和小分子代谢产物特性的研究较少。因此，探讨不同加工年限诺邓火腿微生物多样性及小分子代谢产物的变化，对揭示火腿品质形成具有重要意义。采用高通量测序和气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）技术对诺邓火腿微生物多样性和小分子代谢产物进行分析，以明确诺邓火腿在不同加工年份的品质变化，并进一步分析微生物多样性与代谢产物之间的关系，为诺邓火腿的加工和质量控制提供科学的理论依据。

Results and Discussion

不同加工年份诺邓火腿中细菌多样性

采用高通量测序技术对3个不同加工年份的诺邓火腿样品进行了16S rRNA序列测定，共获得239927条序列。加工1年、2年和3年的诺邓火腿样品中细菌基因组序列数分别为79944、80033和79950。获得原始序列后，将原始序列用于质量控制，并过滤嵌合体以获得有效序列号。加工1年、2年和3年的诺邓火腿样品的有效序列号分别为74272、74337和73734。样品中细菌基因组的GC含量为G和C碱基占总碱基的百分比，GC含量越高，DNA序列越稳定。Q30是质量值大于或等于30的碱基占碱基总数的百分比。Q20是质量值大于或等于20的碱基占碱基总数的百分比。有效是有效序号与原始序号的百分比。结果表明，诺邓火腿的GC含量在50%以上，Q20在98%以上，Q30在94%以上，有效性在90%以上，数据可靠。

从图1A可以看出，不同加工年份的诺邓火腿样品主成分1（PC1）和PC2分别解释了不同加工年份的43.3%和22.4%的细菌群落。从图1A可以看出，不同加工年份的诺邓火腿样品的细菌群落比较分散，说明不同加工年份的诺邓火腿样品的细菌群落存在明显差异。

图1C显示了相对丰度最高的10个门，不同加工年份的诺邓火腿样品中丰度较高的细菌门为变形菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、放线菌门和蓝藻门。变形菌在加工1年、2年和3年的诺邓火腿中的门级相对丰度分别占28%、34.67%和34.67%。加工1年的火腿中厚壁菌门的比例最高，其次是加工3年的火腿。诺邓火腿中酸杆菌的相对丰度在第二年样品中最高，在第一年样品中最低。放线菌的相对丰度在第二年样品中最高，在第三年样品中最低。蓝藻的相对丰度在第三年样品中最高，在第二年样品中最低。变形菌门和厚壁菌门在不同加工年份的诺邓火腿样品中均相对丰富，说明变形菌门和厚壁菌门是诺邓火腿样品中的优势菌门。同样，变形菌门和厚壁菌门是西班牙型香肠门水平上的主要发酵相关类群。在盘县火腿（一种传统的中国肉制品）中发现的优势门也是变形菌门和厚壁菌门。

图1D选择前20个细菌属用于柱状图分析。其中葡萄球菌属是诺邓火腿中的优势菌属。随着加工时间的延长，葡萄球菌的相对丰度不断增加。加工3年的火腿中葡萄球菌的相对丰度占37.71%，比加工1年和2年的火腿分别高93.09%和1.55%。这些差异可能与火腿加工过程中水分含量降低导致含盐量增加有关，葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌，嗜盐，其相对丰度随加工时间和盐度的增加而增加。在通过高通量测序技术对金华火腿加工过程中的微生物区系进行的研究中，发现金华火腿加工过程中的优势菌为葡萄球菌。随着加工时间的延长，诺邓火腿样品中沙雷氏菌和涅斯特连科菌的相对丰度也随之增加，这可能与葡萄球菌协同作用，对诺邓火腿品质的形成起着重要作用。

不同加工年限诺邓火腿中真菌多样性的研究

从图1B可以看出，不同加工年份诺邓火腿样品的PC1和PC2分别解释了不同加工年份真菌群落信息的39.7%和17.0%。这两个PC可以更好地解释样品中真菌群落的信息。从图1B可以看出，不同加工年份的诺邓火腿样品的真菌群落比较分散，说明不同加工年份的诺邓火腿样品的真菌群落存在明显差异。诺邓火腿中子囊菌门的相对丰度最高，其次是担子菌门。随着加工时间的增加，子囊菌相对丰度增加，加工1年、2年和3年的诺邓火腿样品中子囊菌相对丰度分别占55.33%、61.67%和63.33%。而担子菌相对丰度则有所下降，分别占加工1年、2年和3年的诺邓火腿样品的29.33%、25.00%和13.00%。子囊菌门和担子菌门是肉制品中的优势菌门，对肉质的形成起着重要的作用。

图1F显示了诺邓火腿中相对丰度排名前10位的真菌。曲霉菌是诺邓火腿样品中相对丰度最高的真菌，分别占加工1年、2年和3年诺邓火腿样品真菌群落的7.73%、10.58%和9.11%。研究表明，曲霉在食品发酵中起着至关重要的作用。德巴利酵母菌相对丰度以加工2年的诺邓火腿最高，达19.37%。此外，在诺邓火腿中还检出了未分类真菌。

不同加工年限诺邓火腿小分子代谢产物的研究

分析决定发酵火腿质量的代谢产物和代谢途径，有助于有效控制火腿质量。传统的HPLC和GC技术具有明显的局限性。本研究采用GC-TOF-MS分析小分子代谢物，具有高灵敏度和高分辨率的特点。对信号和质谱数据进行提取和预处理，利用LECO-Fiehn Rtx 5数据库进行物质鉴定。GC-TOF-MS共鉴定出252个小分子代谢产物，经多元统计分析筛选出12个重要代谢产物。图2A显示了不同加工年份的诺邓火腿和QC样品的PCA得分。该图表明，所有样品均在95%置信区间内，表明不存在异常值。QC样品汇集在一起，表明仪器在整个检测过程中运行稳定。PCA模型的累积解释变量为36.7%，PCA评分图中所有样本均分布在不同地区，表明不同加工年份诺邓火腿小分子代谢物组分存在明显差异。

为了确定不同加工年限诺邓火腿中代谢产物的差异，进一步采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型对样品进行分类。该模型能够降低数据的维数，过滤掉代谢物中与分类变量无关的变量，有效降低组间差异，从而获得更可靠的代谢物组间差异。图2B显示了不同加工年份的诺邓火腿样品的PLS-DA评分。不同颜色的区域代表不同的样品组。从图2B可以看出，所有样品均在95%置信区间内，可以有效区分三个不同加工年份的诺邓火腿样品。模型的贡献率为92.9%，R2＝0.936，Q2＝0.763，用R2和Q2评价模型的有效性。R2和Q2分别表示模型对Y变量的解释能力和模型的可预测性。这两个值应大于0.5，最好接近1。结果表明，该模型对不同加工年份的诺邓火腿样品具有较高的解释率和较好的预测能力。负荷图反映了样品组间代谢物的贡献率。离原点越远，代谢物对样品组的贡献越大。图2C为不同加工年份诺邓火腿的PLSDA负荷图。如图2D所示，进行PLS-DA模型的交叉验证，并选择具有高R2和Q2的组。在本实验中，PLS-DA模型的R2和Q2分别为0.9894和0.8799，表明PLS-DA模型具有良好的质量和预测能力。

图2E为不同加工年份诺邓火腿代谢物变量影响投影（VIP）评分图，用于评价变量的重要性及其对样品区分的贡献。图中显示VIP值最高的前15种小分子代谢物，右侧颜色用于反映各组代谢物的含量。一般来说，VIP值越大，对样本区分度的贡献越大。一般认为VIP＞1有显著性差异。从图中可以看出，前15种代谢产物的VIP值均大于1。其中，缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、L-别苏氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、D-(1-磷酸甘油)、乙醇胺、琥珀酸、2,4-二氨基丁酸和谷氨酸的含量随着火腿加工年限的延长而增加。加工1年的诺邓火腿甘油含量最高，而加工2年的诺邓火腿甘油含量最低。肌苷含量的变化与甘油的变化相反。三年制诺邓火腿中蛋氨酸含量最高。

基于方差分析的P值和PLS-DA预测中的VIP值的分析是区分食品发酵过程中发生显著变化的化合物的有效方法。如图2F所示，加工1年和2年的诺邓火腿样品的显著差异代谢物首先聚类为一类，然后与加工3年的诺邓火腿样品聚类为一类。不同年份加工的诺邓火腿中各差异代谢物的含量分布与VIP评分图分析结果一致。

采用Pearson相关性检验建立不同代谢物之间的相关性，进而了解不同代谢物之间的关系，分析不同代谢物之间的相关程度。图中横、纵坐标代表不同代谢物，不同位置的色块代表相应位置代谢物之间的相关系数。红色表示正相关，绿色表示负相关，颜色越深，相关性越强。如图3A所示，蛋氨酸含量与2,4-二氨基丁酸、鸟氨酸、琥珀酸、Nα，Nα-二甲基-L-组氨酸、L-别苏氨酸、缬氨酸和乙醇胺的变化呈正相关，而与谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的变化无关。

蛋白质降解、脂肪氧化及相关的酶促反应是腌火腿加工过程中形成风味物质的重要途径。学者们发现，游离氨基酸及其衍生物在火腿风味中起着重要作用，而大多数游离氨基酸是由蛋白质和多肽在酶的作用下形成的。在干腌火腿的加工过程中，氨基酸对火腿的苦味、鲜味和甜味等风味起着重要作用。不同的氨基酸具有不同的味觉阈值，根据其独特的风味分为鲜味、甜味、苦味和无味。以往的研究报道，脯氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和酪氨酸对火腿的苦味有影响，而甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和赖氨酸对甜味有影响。此外，肌肽是一种来源于组氨酸的二肽，具有很强的缓冲和抗氧化作用。有研究表明，干腌火腿中肌肽的含量随着火腿加工过程的进行而增加，这与本实验中肌肽的变化相一致。

为了探索诺邓火腿在不同发酵时期的潜在代谢途径，利用Metabo Analyst 5.0平台对诺邓火腿不同代谢产物的代谢途径进行分析。如图3C所示，通过途径分析获得了23条代谢途径。基于影响值＞0.01，选择了8个关键代谢途径。通过KEGG分析、Pub Chem分析、Pathway分析和网络分析，对甘氨酸、L-苏氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、乙醇胺、琥珀酸和谷氨酸等8种关键代谢物进行了图谱分析，结果均准确匹配。谷氨酸参与4条代谢途径，甘氨酸参与2条代谢途径。说明这些不同的代谢产物处于多个途径的交叉点，对途径有很大的影响。

不同加工年份诺邓火腿微生物与差异代谢产物的相关性分析

一般认为，发酵食品中代谢产物的形成和变化与微生物群落密切相关。为探讨诺邓火腿差异代谢产物与微生物之间可能存在的关系，采用斯皮尔曼分析法对差异显著植物群与16S rRNA和ITS分析获得的差异代谢产物进行相关性分析（图3B）。颜色越红，植物群与差异代谢产物的正相关性越强，颜色越蓝，植物群与差异代谢产物的负相关性越强。在本研究中，选择属水平上相对丰度前20名的细菌和前10名的真菌进行相关性分析，筛选出60种不同的代谢产物。从图3B可以看出，主要微生物植物群与差异代谢产物之间存在一定的相关性。

Conclusion

通过比较分析不同加工年份诺邓火腿的微生物群落和小分子代谢产物的变化，发现不同加工年份诺邓火腿的微生物群落组成存在明显差异。在门水平上，变形菌门和核盘菌门是细菌的优势属，而子囊菌门和担子菌门是真菌的优势属。在属级水平上，葡萄球菌属是诺邓火腿的优势细菌，曲霉属是诺邓火腿的优势真菌。这些微生物的存在可以抑制某些病原微生物的生长发育，对提高火腿的品质具有重要意义。通过多元统计分析，筛选出12种不同的代谢产物，代谢途径分析表明23条代谢途径与火腿发酵相关，其中8条代谢途径影响显著。这些微生物优势菌与差异代谢产物密切相关。肌酸、肌肽和L-脯氨酸与葡萄球菌属和沙雷氏菌属的丰度呈正相关，与假单胞菌属和短杆菌属的丰度呈负相关。在诺邓火腿加工过程中，微生物影响了火腿中小分子代谢物的代谢途径，直接导致火腿品质的变化。这些研究结果为进一步了解诺邓火腿品质形成机理提供了新的思路。但下一步还需要确认优势微生物与小分子代谢产物之间的关系。

Variation of microbiological and small molecule metabolite profiles of Nuodeng ham during ripening by high-throughput sequencing and GC-TOF-MS

Cong Lia,b,1, Yingling Zoua,b,1, Guozhou Liaoa,*, Zijiang Yanga,b, Dahai Gua,b, Yuehong Pua,b, Changrong Gea, Guiying Wanga,b,*

a Livestock Product Processing and Engineering Technology Research Center of Yunnan Province, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

b College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

The internal microbial diversity and small molecular metabolites of Nuodeng ham in different processing years (the first, second and third year sample) were analyzed by high-throughput sequencing technology and gas chromatography-time of flight mass spectrography (GC-TOF-MS) to study the effects of microorganisms and small molecular metabolites on the quality of ham in different processing years. The results showed that the dominant bacteria phyla of Nuodeng ham in different processing years were Proteobacteria and Firmicutes, the dominant fungi phyla were Ascomycota and Basidiomycota, while Staphylococcus and Aspergillus were the dominant bacteria and fungi of Nuodeng ham, respectively. Totally, 252 kinds of small molecular metabolites were identified from Nuodeng ham in different processing years, and 12 different metabolites were screened through multivariate statistical analysis. Further metabolic pathway analysis showed that 23 metabolic pathways were related to ham fermentation, of which 8 metabolic pathways had significant effects on ham fermentation (Impact > 0.01, P < 0.05). The content of L-proline, phenyllactic acid, L-lysine, carnosine, taurine, D-proline, betaine and creatine were significantly positively correlated with the relative abundance of Staphylococcus and Serratia, but negatively correlated with the relative abundance of Halomonas, Aspergillus and Yamadazyma.

Reference:

LI C, ZOU Y L, LIAO G Z, et al. Variation of microbiological and small molecule metabolite profiles of Nuodeng ham during ripening by high-throughput sequencing and GC-TOF-MS[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 2187-2196. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250182.

翻译：农梦琪（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意