东北农业大学食品学院张佳佳、马艳秋副教授、高鑫副教授等以添加/未添加蛋黄肽的冰蛋黄为研究对象，测定蛋黄蛋白质的功能、结构和理化性质，分析相关性，为蛋黄加工副产物的蛋白酶解物发展为一种抗冻保护剂提供依据。

Introduction

冷冻是食品加工中广泛使用且有效的保藏技术，可以解决液蛋在运输过程中微生物污染和品质劣变的问题，延长液蛋制品保质期。然而，蛋黄在冷冻和冷冻贮藏过程中容易受到冰晶生长和再结晶的损害，即－18 ℃超6 h冷冻后，通过组分间的相互作用发生凝胶化，这种不可逆的损伤会影响蛋白质的宏观性质和微观结构，用机械处理则会使蛋黄呈斑点状分散，难与其它食品组分混合，严重影响冰蛋黄的后续应用。

脱脂蛋黄粉是提取蛋黄油和卵磷脂产生的副产物，含有多种蛋白质，但残留的有机溶剂会导致脱脂蛋黄粉的功能特性丧失，造成蛋黄蛋白的极大浪费。脱脂蛋黄粉可以通过分馏应用于各种食品加工中，或制备为功能性肽提高其利用价值，有研究报道了利用酶水解生产的肽具有抗炎、抗氧化、抗高血压和抗糖尿病等生物活性。目前已有学者报道了蛋黄肽抑制蛋黄冷冻凝胶化的良好效果，当添加量达到5%时，就可以有效抑制冰蛋黄的凝胶化。然而，有关蛋黄肽对蛋黄冷冻前后蛋白质性质变化的信息仍然有限，由于不同食品对蛋黄蛋白质特性的要求不同，因此探究蛋黄蛋白质经冷冻后功能、结构以及理化性质的变化对其后续加工具有重要意义。

Results

1 添加肽的未冷冻和冻融蛋黄功能特性的变化

由于冷冻引起的凝胶化现象，蛋黄的黏度增加，肽通过冰水界面的某种相互作用吸附在冰晶表面从而控制冰晶的大小、形状和聚集，在冻融过程中保护蛋白质，因此这3 种蛋黄肽都可以在一定程度上使蛋黄恢复流动性。蛋白质溶解度直接反映了蛋白质的变性和聚集程度，冷冻后所有样品的溶解度都显著降低，即使蛋白质在冷冻后很大程度上变性，但其中一些聚集体仍可溶于水。其中，不含蛋黄肽的样品（the samples without egg yolk peptides，FEY）溶解度下降87.98%，这是由于蛋黄中水分子结冰时产生的冰晶挤压蛋白分子，导致低密度脂蛋白和其他可溶性蛋白质的二级以上结构发生变化，导致疏水基团暴露和疏水相互作用，从而导致蛋白质聚集体的形成，表现为溶解度降低，而肽可以与水形成氢键同时通过屏蔽蛋白质的疏水性、易聚集区域来抑制聚集，从而提高了溶解度。冷冻后乳化活性的升高可能是由于冷冻暴露蛋白质分子内的疏水基团，增强蛋白质的柔韧性，促进蛋白质分子在油水界面的吸附和重排。

字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。下同。

图1 添加多肽的未冷冻和冻融蛋黄状态（A）、黏度（B）、溶解度（C）、乳化特性（D～E）

2 添加肽的未冷冻和冻融蛋黄结构特性的变化

所有样品的峰型未发生明显变化，但冷冻后3 000 cm－1以上的波数与峰强度发生了改变，说明蛋黄蛋白的结构发生了一定改变，添加蛋黄肽会使得峰强度变化的幅度减小并且高于FEY，这可以说明蛋黄肽在一定程度上可以减弱冷冻导致的氢键相互作用增强，且可能是由于冷冻保护剂中的—OH基团与蛋白质结合形成稳定的结构，抑制了冷冻后蛋黄蛋白质的聚集和变性。

下标1和2分别表示未冷冻蛋黄和冻融蛋黄。下同。

图2 添加多肽的未冷冻和冻融蛋黄的傅里叶变换红外光谱

所有样品的荧光光谱图形状相似，但冷冻前肽的添加会使得最大荧光强度升高，这可能是由于肽表现出的内源荧光。而冷冻后的蛋黄样品荧光强度均降低，这可能是由于冷冻使蛋白质的空间构象发生改变，包裹在疏水区域的酪氨酸和色氨酸开始暴露并与极性环境接触，导致冷冻诱导的蛋白质氧化和聚集增加，这些蛋白质分子聚集体猝灭暴露的发色团，从而降低荧光强度，这说明冷冻会导致蛋白质三级结构发生改变。添加蛋黄肽后，3 组的内源荧光强度的减少低于FEY和Y(B)0 h，表明色氨酸残基暴露较少，蛋白质变性程度较轻，说明蛋黄肽对冷冻造成的蛋白质三级结构改变具有一定的保护作用。

图3 添加多肽的未冷冻和冻融蛋黄的荧光光谱变化

3 添加肽的未冷冻和冻融蛋黄理化特性的变化

在冷冻之前，所有样品的浊度不超过0.3，其中FEY浊度为0.162，表明其在溶剂中具有良好的分散性。在冷冻后，FEY与Y(B)0h的浊度迅速增大，冷冻过程中形成了较大的不溶性聚集体和致密且连续的蛋黄凝胶，蛋白聚集后颗粒直径会增大，导致浊度上升；蛋黄肽组表现出较低的浊度（0.155～0.170），表明蛋黄肽可以有效抑制冻融引起的蛋黄颗粒聚集，使得这3 组蛋黄的浊度可以与新鲜蛋黄相媲美。未经冷冻的蛋黄样品的粒径呈单峰分布，并且集中在10～100 μm，表明颗粒尺寸是均匀分布的。而冷冻后样品呈现出多峰并且粒径分布逐渐右移，说明颗粒尺寸增加，表明形成了更多不溶性大聚集物。冷冻后游离—SH含量增大，表明蛋白质分子内发生了—SH的暴露或二硫键的断裂，这可能是由于蛋黄蛋白质发生构象变化导致的，因为蛋白质的三级结构不稳定会使得结构松散暴露出新的游离巯基。也可能是因蛋白质变性聚集使能被检测到的巯基含量减少。添加蛋黄肽的游离巯基在冷冻后低于FEY和Y(B)0 h，这与溶解度的变化趋势相反。

图4 添加多肽的未冷冻和冻融蛋黄的浊度（A）、游离巯基含量（B）和粒径分布（C）变化

4 相关性分析

黏度与游离巯基含量和浊度呈正相关，与FImax呈负相关。溶解度与浊度和游离巯基含量呈负相关，与d0.5和FImax呈正相关，β-折叠相对含量显著影响游离巯基含量和d0.9。此外，蛋白质三级结构的改变也会影响其理化性质。这些结果表明，蛋黄肽在蛋白质冷冻过程中保护蛋白质，有助于维持蛋白质二级和三级结构的稳定性，提高蛋白质的功能性质。

*P＜0.05；**P＜0.01。

图5 蛋白质性质相关散点图

Conclusion

研究表明，由于冷冻后的冰晶形成和蛋白质聚集，蛋黄蛋白质的结构完整性在冻融后被破坏，发生凝胶化现象，导致黏度、浊度、粒径增大，游离巯基增加，溶解性降低。以脱脂蛋黄粉为原料，通过不同酶解时间制备的蛋黄肽对蛋黄蛋白质具有良好的冷冻保护作用，蛋白质二级、三级结构的变化表明，蛋黄肽的加入可以有效抑制蛋白质的变性，减轻蛋白质的结构变化，并降低蛋白质功能和理化性质的改变。

Abstract

Egg yolk peptides were prepared by enzymatic hydrolysis of defatted egg yolk powder. The cryoprotective effects of these peptides were assessed by examining the functional, structural and physicochemical properties of egg yolk. Results indicated that egg yolk peptides could reduce viscosity and prevent the accumulation of egg yolk proteins during freezing, thereby mitigating the deterioration of its functional characteristics. The peptide hydrolyzed for 3 h demonstrated the lowest fluidity in thawed egg yolk. Additionally, Fourier transform infrared (FTIR) spectra and intrinsic fluorescence spectra revealed that egg yolk peptides could reduce damage to the secondary and tertiary structures of proteins, enhancing the stability of the protein network. Changes in the content of secondary structures showed that egg yolk peptides increas ed β-turns, decreased β-sheets, and maintained overall structural stability and strength. This study provides new insights for egg yolk peptides to inhibit frozen egg yolk gelation.

作者介绍

马艳秋 副教授

东北农业大学食品学院

马艳秋，女，东北农业大学食品学院副教授，硕士生导师，国家二级公共营养师，亚洲蛋品协会、中国畜产品加工研究会、黑龙江省食品科学技术学会、黑龙江省天然产物工程学会会员。《食品研究与开发》和《中国家禽》青年编委，期刊审稿专家。研究方向为蛋品科学与技术，近年来主持国家自然基金青年项目、黑龙江省自然科学基金项目等国家及省部级项目4 项，参与国家自然科学基金面上项目、黑龙江省重点研发计划项目等国家级及省部级等项目5 项。发表学术论文40余篇，其中一区TOP论文10余篇。授权发明专利1 项（排名第四）。累计参加国内外学术会议并进行学术报告10余次。

高鑫 副教授

东北农业大学食品学院

高鑫，女，东北农业大学食品学院副教授，硕士生导师，研究方向为农产品加工及贮藏工程和蛋品深加工。

张佳佳 硕士研究生

东北农业大学食品学院

张佳佳，女，2022级硕士研究生，就读于东北农业大学食品学院，研究方向为蛋品科学与技术。

文章内容由作者团队提供。

编辑：阎一鸣； 责任编辑：刘莉