近日，美国康奈尔大学团队开发出一种新型多光子显微镜——DEEPscope。
通过定制的全光学系统和大口径多边形扫描仪，以及结合激光自适应激发技术，DEEPscope 能够实现亚微米分辨率，并能实现 1mm 深度的结构成像，成像范围涵盖小鼠的所有大脑皮层和部分海马区。
在三光子脑成像中，DEEPscope 能够大大提升成像速度和成像广度，能以 4Hz 的帧率实现 3.23×3.23mm² 的大视野成像。
除能拓宽光子成像的深度和广度之外，通过优化多光子荧光信号的生成效率，DEEPscope 还能克服双光子成像深度和三光子成像视野的限制，从而能够实现深层大视野成像。
此外，DEEPscope 采用多光束扫描方案和自适应激发系统，这让其具有模块化和可扩展的特点，故能大幅降低大视野多光子成像系统的复杂性，因此能够集成到任何多光子显微镜中。
目前，DEEPscope 已能用于鼠脑和成体斑马鱼的大视野深层成像，这证明它在各种模型生物或组织样本中也具有广泛应用潜力，比如也能用于肿瘤和淋巴结的成像，从而能够用于研究免疫细胞在淋巴结中的动态行为，以及用于观测肿瘤微环境中的结构和细胞活动。
为了方便应用落地，研究人员采用供应商的定制模块化方案，让 DEEPscope 能够实现高性能和便捷性的平衡。目前，这家供应商已经将这些定制组件加以商品化，因此用户可以直接购买。
总的来说，DEEPscope 不仅能实现高效、快速和大视野的三光子成像，还能显著扩展多光子显微镜的应用潜力，为实现多光子显微镜的大视野、深层次、高分辨率成像提供了良好解决方案，并能被用于免疫学和神经科学等领域。
用大视野深度成像助力疾病研究
谈及研究背景该团队表示，一些神经系统疾病会损害记忆力和运动能力，并会严重降低生活质量。要想深入理解这些复杂疾病的机制，基础性生物研究必不可少，而最直接的办法就是观察和追踪实验小鼠的神经元细胞活动。
然而，此前的成像技术依旧无法收集到足够多和足够好的数据，比如无法同时观测深层神经元和大范围神经元的活动。
要想理解神经系统的疾病机制，大视野深度成像可谓极为关键。近年来，随着双光子显微镜技术的发展，已让神经活动的大视野记录成为可能。然而，该类技术的成像深度仍然局限于浅表皮层。
针对深层皮层表面和深层皮层之下的海马区区域中的神经元，尽管传统三光子显微镜能够对其进行成像，但其成像范围依旧局限于几百微米的小视野之内。
这是因为随着成像深度的增加，激光能量也会增强。但是，过高的激光能量会导致生物组织温度升高，从而引发组织损害（即热损伤）。而通过缩小成像视野，则能减少所需的激光能量，从而降低热损伤的风险。
要想解决深层大视野的成像瓶颈以及实现大视野三光子显微镜，就必须提高荧光信号生成的效率，只有这样才能降低成像所需的激光能量。
基于上述观察，课题组定下这样一个目标：开发一种能够同时实现深层次、高分辨率和大视野成像的新型显微镜。
“神经元像星星一样闪烁”
要想完成这一目标首先需要解决大视野成像中的一个关键挑战：提高三光子成像的荧光激发效率。
为此，他们定制了多边形扫描器和光学系统（包括扫描透镜和物镜管透镜）。通过反复的实验和调整，该团队构建出了 DEEPscope。
完成硬件开发之后，其又针对 DEEPscope 进行性能验证。针对速度、分辨率和成像深度等关键参数进行表征之后，表征结果显示 DEEPscope 在深层成像和大视野成像中具有优越性。
此外，他们还在小鼠和斑马鱼等模型生物中进行活体成像实验，进一步验证了 DEEPscope 的稳定性和实用性。
同时，课题组还针对成像数据加以深入分析，以便全面验证 DEEPscope 的性能。
通过评估神经元的荧光信号亮度，其发现 DEEPscope 在深层组织中仍能保持较高的信噪比，借此展示了 DEEPscope 在激发效率优化上的有效性。
同时，研究人员还记录了深层神经元的神经活动模式，这不仅清晰展示了神经元的动态过程，也为深入研究大脑活动提供了强有力的数据支持。
而 DEEPscope 的应用并非仅仅局限于小鼠模型，该团队还将其扩展至斑马鱼成体脑的研究之中。
斑马鱼的实验结果显示：DEEPscope 能够实现大视野范围内的高分辨率结构成像，这证明其在不同模型生物中具有广泛的适用性。
实验中，扫描器的同步、激光功率的调控、以及荧光信号的捕捉，都需要精准的参数配合。之所以要调试 DEEPscope 的参数，是为了在针对最深层皮层实现成像的同时，还能让其保持大视野。
而最深层皮层位于小鼠的大脑深处，同时要想实现大视野就必须具备极高的荧光激发效率。
研究中，课题组在实验室连续调试好几个小时，期间他们反复尝试不同的激光分布模式。每当实验失败时，他们都会记录下问题，重新分析光路和信号处理流程。
终于，屏幕上开始呈现出一片清晰的图像——最深层皮层神经元活动，分布在了一个前所未有的大视野范围内。
这张图像不仅展示了几百个最深层皮层的神经元，还能展示出每个神经元的细节，研究人员形容这就像是打开了一扇通往脑深处的窗口。
作为本次项目的主导者，莫浚贤和王天宇这样描述上述场景：“当时已是深夜，实验室里一片安静。
我们盯着屏幕，感到一种不可思议的满足和兴奋。这是第一次亲眼看到 DEEPscope 所实现的大脑最深层皮层的大视野成像。”
“当看到图像上活跃的神经元像星星一样闪烁，我们觉得自己仿佛是一名宇航员在探寻神秘太空的奥秘。”其补充称。
概括来说，他们在本次研究中引入了一系列创新：利用多光束扫描方案来提高荧光生成效率、利用自适应激发方式来降低所需的平均功率。
其中，多光束扫描方案通过将单个激光脉冲分成多个小光束来监测神经元活动，从而能够显著提高荧光信号生成效率，进而能够降低激光功率。
自适应激发模块则能将激光脉冲集中用于目标成像区域，从而可以进一步减少激光功率。
在传统的多光子显微镜中，激光能量通常均匀分布于整个样本，这种方式会导致能量浪费，尤其在无需成像的区域会增加热损伤的风险。
而这些创新让三光子中每个激光脉冲的荧光生成得以优化，从而让深层大视野成为可能。
而通过数据分析和性能验证，课题组不仅展现了 DEEPscope 在神经科学研究中的核心优势，还为它在其他生物医学领域的潜在应用奠定了基础。
日前，相关论文以《一种具有大视野、单细胞分辨率的两光子和三光子显微镜，可进行深度和宽度的成像》（A large field-of-view, single-cell-resolution two- and three-photon microscope for deep and wide imaging）为题发在eLight（IF 27.20），并当选为封面论文。
本次项目由莫浚贤和王天宇共同设计主导，康奈尔大学教授 Chris Xu 担任通讯作者 [1]。
其中，王天宇现任美国波士顿大学电子计算机工程系助理教授，主要研究实验光学和人工智能交叉等方向。
参考资料：
1.Mok, A.T., Wang, T., Zhao, S.et al. A large field-of-view, single-cell-resolution two- and three-photon microscope for deep and wide imaging.eLight4, 20 (2024). https://doi.org/10.1186/s43593-024-00076-4
运营/排版：何晨龙
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