J. Future Foods | 基于分子对接和分子动力学模拟的香菇酶解提取物生物活性肽筛选策略|分子动力学|分子对接|受体|复合物|多肽|桑黄|活性|香菇

本文系Journal of Future Foods原创编译，欢迎分享，转载请授权。

Introduction

生物活性肽一般含有2～20 个氨基酸，分子质量小于6 000 Da，具有良好的生物活性。目前，食用菌中生物活性肽的研究主要集中在抗氧化、降压、抗菌和免疫调节等方面。血管紧张素转换酶（ACE）是一种含Zn2+的二肽基转换酶。通过催化非高血压性血管紧张素I向高血压性血管紧张素II的转化，使具有血管舒张作用的缓激肽失活，导致血压升高。二肽基肽酶（DPP-IV）是一种位于细胞表面的丝氨酸肽酶，属于膜蛋白。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性胰岛素释放肽（GIP）能诱导β细胞分化，刺激胰岛素的产生和释放，但它们的半衰期极短，在体内会被DPP-IV迅速降解。因此，通过抑制DPP-IV来延长GLP-1和 GIP 在体内的半衰期，维持血糖的稳定。抗氧化活性物质在人体衰老和免疫系统中尤为重要。其中，抗氧化肽通过激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路，激活一系列具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白表达，从而发挥抗氧化功能。同时，多肽还具有一定的食品风味特征，如鲜味、咸味等。从食品蛋白质中提取或由氨基酸合成的风味肽，因其在天然食品和加工食品中具有独特的风味而受到广泛关注。与传统的调味剂相比，具有生物活性的风味肽具有更好的开发前景和额外的应用价值。

近年来，利用计算机工具获取生物活性肽已成为研究的热点之一。BIOPEP、PeptideDB、CAMP等数据库，已经被用来预测多肽的理化性质和生物活性。分子对接和分子动力学模拟是研究蛋白质与分子相互作用的常用方法。分子对接可以根据受体与配体的结合相互作用力来揭示它们相互作用的结合位点。分子动力学模拟可以考虑蛋白质和小分子的构象变化，获得模拟系统中各组分的动力学、热力学或结构性质。

上海市农业科学院食用菌研究所加工室硕士研究生陈道游（第一作者）、李文研究员、杨焱研究员（共同通信作者）等在已构建的多肽数据库的基础上，利用计算机虚拟筛选技术，从香菇酶解提取物中筛选具有鲜味、咸味和ACE、DPP-IV潜在抑制活性的多肽，为多功能活性风味肽的快速筛选提供了一种新方法，并为香菇高附加值加工产品的多维度开发利用提供了理论支持。

Results

潜在生物活性肽的筛选

在先前筛选的272 个具有潜在咸味和鲜味特征的风味肽中，发现95 个Peptideranker排名得分＞0.50的肽。BIO-UWM进一步预测了多肽的ACE和DPP-IV的抑制活性，发现评分≥0.5的肽段有50 条。多肽的毒性在研究多肽的生物活性中起着特别关键的作用，其中48 种多肽被ToxinPred工具预测为无毒。用AllerTOP v.2.0工具预测了48 条多肽的致敏性，其中19 条为过敏原，29 条为非过敏原。最后，从29 条非致敏多肽中筛选出15 条溶解度较好的潜在生物活性肽，包括3 条七肽、4 条八肽、3 条九肽、4 条十肽和1 条十三肽。

潜在生物活性肽与ACE和DPP-IV受体的分子对接

为探究15 种潜在生物活性肽与ACE和DPP-IV受体的结合机制，进行了生物活性肽与ACE和DPP-IV受体的分子对接分析。通过计算机模拟构建了ACE受体和DPP-IV受体三维模型（图1），结果表明，15 种多肽可以进入ACE和DPP-IV的结合口袋，多肽与ACE受体的平均对接能为－14.4671 kcal/mol，与DPP-IV受体的平均对接能为－10.5944 kcal/mol。DAPLPHPNR、GSEDPLPGAK与ACE受体和DPP-IV受体的结合能较低，2 种多肽可能具有较强的ACE和DPP-IV抑制活性。氢键和静电相互作用是肽与ACE受体、DPP-IV受体之间的主要作用方式。

图1 ACE和DPP-IV受体的三维表面结构（A、B）和15 种潜在生物活性肽与ACE和DPP-IV受体的对接结果（C、D）

2 种潜在生物活性肽与ACE和DPP-IV受体的分子动力学模拟

为进一步评估2 种潜在的生物活性肽与ACE和DPP-IV受体的相互作用，采用分子动力学模拟研究了ACE-肽复合物和DPP-IV-肽复合物的均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、旋转半径（Rg）及复合物氢键数的动态变化。如图2所示，DAPLPHPNR和GSEDPLPGAK与ACE受体和DPP-IV受体结合复合物在5 ns后达到平衡。与其余3种复合物相比，DAPLPHPNR-ACE在所有动力学模拟中表现出更高的稳定性。

A. RMSD；B. RMSF；C. Rg曲线；D.肽受体复合物的氢键数。

图2 2 种潜在生物活性肽与ACE和DPP-IV受体在50 ns内的分子动力学相互作用

体外合成肽的ACE和DPP-IV抑制活性分析

由表1可知，当浓度为2 mg/mL时，两种多肽的抑制率均在50%以上。与合成肽相比，DAPLPHPNR和GSEDPLPGAK的ACE半抑制浓度分别为0.08、0.6 mg/mL。在浓度为2 mg/mL时，DAPLPHPNR对DPP-IV的抑制率为62.13%，半抑制浓度为0.89 mg/mL；GSEDPLPGAK的抑制率为56.68%，半抑制浓度为1.32 mg/mL。

表1 2 种合成肽的体外ACE和DPP-IV抑制活性的测定

合成肽对DPPH和ABTS+自由基的剂量效应

由图3可知，在0.025～1.000mg/mL内，DAPLPHPNR和GSEDPLPGAK对DPPH自由基的清除率呈剂量依赖增加趋势。作为阳性对照，抗坏血酸对DPPH自由基的半抑制浓度为0.004 mg/mL。DAPLPHPNR对DPPH自由基的半抑制浓度（0.36 mg/mL）显著低于GSEDPLPGAK（0.52 mg/mL）。2 种肽对ABTS+自由基的清除能力表现出相似的趋势。与DAPLPHPNR相比，GSEDPLPGAK对ABTS+自由基的清除能力较低。ABTS+自由基清除的半抑制浓度值为：抗坏血酸（0.042 mg/mL）＜DAPLPHPNR（0.16 mg/mL）＜GSEDPLPGAK（0.24 mg/mL）。

图3 2 种生物活性肽的DPPH和ABTS+自由基清除曲线

Conclusion

本研究采用生物信息学、分子对接、分子动力学模拟以及体外活性评价等技术，筛选鉴定了香菇酶解风味肽中具有抑制ACE和DPP-IV作用的生物活性肽。通过生物活性、毒性、致敏性、溶解度等指标，从272种香菇风味肽中筛选出15 种潜在的生物活性肽。分子对接结果表明，15 种潜在的生物活性肽可以通过氢键和静电相互作用与ACE和DPP-IV结合。ACE中的Glu403、Glu411、Arg124、His387残基和DPP-IV中的Glu206、Arg125、Lys554、Asp545和Arg560残基可能在与潜在生物活性肽的结合中发挥关键作用。2 种多肽（DAPLPHPNR和GSEDPLPGAK）表现出较强的结合能力，分子动力学模拟进一步验证了它们与ACE和DPP-IV受体复合物的稳定性。体外多肽活性评价结果表明，DAPLPHPNR和GSEDPLPGAK对ACE的半抑制率分别为0.08、0.61mg/mL，对DPP-IV的半抑制率分别为0.89、1.32mg/mL。同时，这2种多肽还具有清除DPPH和ABTS+自由基的能力。

第一作者

陈道游，上海理工大学与上海市农科院联合培养2021级硕士研究生，研究方向为食用菌风味成分评价。以第一作者在Food Chemistry、LWT-Food Science and Technology、Journal of Future Foods国际期刊发表SCI论文3 篇，北大中文核心期刊1 篇。参与国家自然科学基金面上项目1项，上海市自然科学基金项目1 项，申请专利1 项，获2023年硕士研究生学业奖学金。

通信作者

李文，上海市农业科学院研究员，硕士生导师；中国食用菌学会会员、上海市食品学会青委会委员。主要从事食用菌风味形成机理及风味强化高效制备技术开发等研究工作。主持及参与国家自然科学基金、上海市自然基金多项风味课题研究工作。围绕食用菌栽培及加工过程中风味缺失及风味强化、风味改良及富集技术缺乏等科学问题和产业问题，进行了系统理论研究和技术突破。主笔发表论文40余篇，其中SCI论文20 篇。主持及参与授权专利16 项。获得2022年度上海市科技进步二等奖1 项。

杨焱，博士，二级研究员，国家百千万人才，国家有突出贡献的中青年专家，上海市领军人才、上海市农业领军人才，博士生导师,上海市农业科学院食用菌研究所加工技术与发酵工程研究室主任。中国食用菌协会药用真菌委员会委员、中国农学会食用菌分会委员、中国菌物学会桑黄产业分会秘书长、上海食品学会理事。主要从事食药用真菌功能营养和精深加工相关研究工作。承担了国家和省市级50余项课题的研究，主持获得上海市科技进步一等奖1项、上海市技术发明奖1 项；参与获得中华神农科技二等奖1项、上海市科技进步三等奖4 项。对珍稀药用真菌桑黄和猴头菌的优良菌种选育、人工驯化、发酵调控、功能性成分的分离鉴定及高效制备、活性物质的作用机制等进行了深入系统的研究，获得了高产活性代谢物的优良菌株及高值利用技术；揭示了天然活性多糖功效作用的结构基础，构建了多糖的精准质控技术和高效制备技术，开发了系列营养健康产品；系统研究了食用菌风味物质产生的关键因素及机制，建立了食用菌风味评价体系。已在国内外学术刊物上发表论文270余篇，其中SCI收录73篇；获国家发明专利授权30 项；获得5项国家健字号批文；认定猴头菌、桑黄等食药用菌新品种6个。

A screening strategy for bioactive peptides from enzymolysis extracts of Lentinula edodes based on molecular docking and molecular dynamics simulation

Daoyou Chen ab1, Xuexiang Shen a1, Wanchao Chen a, Di Wu a, Zhong Zhang a, Peng Liu a, Yanfang Liu a, Wen Li a*, Yan Yang a*

aNational Engineering Research Center of Edible Fungi, Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization (South), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China

bShanghai Engineering Research Center of Food Microbiology, School of Health Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China

1These authors contributed equally to this work.

*Corresponding author.

Abstract

The aim of this study was to quickly discover multifunctional bioactive flavor peptides from the enzymolysis extracts of Lentinula edodes through bioinformatics, molecular docking and molecular dynamics simulation, and to evaluate the synthesized and in vitro activity of the screened peptides. The biological activity, toxicity, allergenicity, solubility and stability of 272 L. edodes enzymolysis flavor peptides were predicted, and 15 potential bioactive peptides were screened. By molecular docking prediction of 15 potential bioactive peptides, it was found that angiotensin-converting enzyme (ACE)'s Glu403, Glu411, Arg124, His387 and dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV)'s Glu206, Arg125, Lys554, Asp545, Arg560 might play a key role in binding to potential bioactive peptides. Among them, DAPLPHPNR and GSEDPLPGAK showed stronger bonding energy, and the stability of their complexes was further verified by molecular dynamics simulation. In addition, the two peptides were synthesized by chemical method, and in vitro experiments showed strong ACE and DPP-IV inhibitory activities, while also having different antioxidant effects. This work provides an efficient method for screening and developing multifunctional flavor peptides in edible fungi.

Reference:

CHEN D Y, SHEN X X, CHEN W C, et al. A screening strategy for bioactive peptides from enzymolysis extracts of Lentinula edodes based on molecular docking and molecular dynamics simulation[ J] . Journal of Future Foods, 2025, 5(4): 388-397. DOI:10.1016/j.jfutfo.2024.07.017.