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这一干扰物质，很多检验人都没见过
撰文| 鲁学萍 沙文彬
凝血结果的正确解读，对于很多检验人和临床医生来说一直是一个老大难问题。这不仅因为凝血试验背后的原理纷繁复杂，更是因为在分析凝血结果时，还需要将不同试验的结果综合起来、做全盘的考量。此外，凝血试验结果时常受到一些来自受检者体内外干扰因素的影响。在这种情况下，凝血结果的解读就变得更为棘手。此时更需要检验人和临床医生开动脑筋，以免得出似是而非的结论。
下面就是近期我们遇到的一个实例。
案例经过
一天临近下班时分，血液科大夫打来电话，抱怨一名患者的凝血报告为何总是没有结果。
我们在LIS中查看该患者的凝血结果，发现确实很蹊跷。入院八天以来，他做了七次常规凝血检测。但是每次PT、APTT和TT都是报告“无凝固”。
表1 患者入院时的凝血结果
注：红色代表结果高于参考上限，蓝色代表结果低于参考下限，以下同。
更奇怪的是，在这八天里，他分五次输注了2000毫升的血浆以及4单位的冷沉淀。一般而言，输入血浆与冷沉淀可以纠正绝大多数凝血功能异常。但他的凝血结果，却一直纹丝不动，这着实诡异。
再查看其它结果，最瞩目的莫过于球蛋白高达127g/L。同时，他还存在贫血、高钙血症（表2）。这些检验结果，都高度提示患者罹患多发性骨髓瘤（MM）。
表2 患者入院时的部分检验结果
我们进一步查阅了该患者的病历：患者男，57岁，因“头晕、乏力、间断鼻出血4月、加重2天”入院。他还存在双侧肋部疼痛。十三年前，他曾因“高血压脑出血”，在我院外科住院。
此次入院后，进一步检查显示，他血液中免疫球蛋白IgG高达124g/L。结合骨髓穿刺等检查结果，他被确诊为多发性骨髓瘤，并开始针对性化疗。
在住院的八天中，该患者不仅输了大量血浆与冷沉淀，同时还输注了维生素K。维生素K相关的凝血功能异常，是血液科最常见的凝血系统疾患。输注血浆、冷沉淀与维生素K都无效，说明患者的情况可能极为罕见。
四个月前，该患者曾在我院外科门诊，以“脑出血后遗症”就诊。当时他的球蛋白为103g/L、血红蛋白为107g/L。四个月间，他的病情进展较快。
案例分析
▌凝血结果的分析与验证
我们知道，纤维蛋白原浓度（FBG）与凝血酶时间（TT）这两种测试的原理相同，都是试剂中的凝血酶作用于血浆中的纤维蛋白原，使其转化为纤维蛋白。只不过，一个直接记录凝固时间（TT），另一个则通过凝固时间换算出纤维蛋白原的浓度（FBG）。因此，正常情况下，FBG与TT存在反相关，即FBG较低时，TT是延长的；反之，FBG较高时，TT则是缩短的。
由于FBG检测需要先对血浆做10倍稀释，同时，该试剂中含有过量的凝血酶。因此，FBG几乎不受干扰物质的影响，能够正确反映血浆中纤维蛋白原的含量。
TT检测则被设计的较为“敏感”。该测试中不稀释血浆，同时反应体系中的凝血酶相对不足。这导致TT检测容易受到内源性或外源性物质的干扰，出现与FBG“矛盾”的结果。
该患者的FBG始终正常，但TT却总是“无凝固”、超出检测上限。这表明他的血液中存在某种干扰物质。该干扰物质显著抑制了体内或体外凝血过程的最后一步——纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变为纤维蛋白。
该干扰物质的存在，在体外凝血试验中，不仅表现为TT试验不凝固。同样使依赖上述最后一步的PT与APTT试验也表现为不凝固。
为了进一步验证该患者的血浆中确实存在干扰物质，我们做了简单的混合试验。将该患者的血浆与同体积正常血浆混匀，然后检测混合血浆，结果见表3。
表3 混合血浆的凝血结果
混合血浆的TT依然偏高；APTT虽然结果正常，但仪器提示“轻度凝集”；PT则正常。
由于凝血因子缺乏导致的凝血结果异常，通过混合试验可以完全纠正。而外源性或内源性干扰物质导致的凝血结果异常，混合试验一般无法完全纠正。
我们的混合试验表明，患者的血浆中确实存在干扰物质。且该物质对TT和APTT的影响更为显著，对PT影响有限。
干扰凝血试验的物质，常见的有狼疮抗凝物。但该患者可以基本排除这种可能。因为狼疮抗凝物一般只干扰APTT结果，极少情况下会干扰PT，TT则完全不受干扰。这与患者的结果明显相左。
存在狼疮抗凝物的患者一般有血栓倾向，而不是出血，这与患者的临床表现也不符。此外，该患者的全套自身抗体测试显示，包含抗心磷脂抗体等的全部项目均为阴性，这也表明不太可能是狼疮抗凝物。
由于条件所限，我们无法进一步实验以确定该干扰物质的成分。我们转而通过文献检索，寻找其可能的成分。
▌文献回顾与讨论
出血是多发性骨髓瘤较常见的临床表现，约三成的患者中会出现。这一般是血小板功能异常、血小板数目减少、血管内皮损伤等导致的。出现明显的凝血试验异常，较为少见[1]。
我们以“multiple myeloma+coagulation+interference”为关键词，检索发现多篇文献的案例细节与本文相似。这些文献中的干扰物质，最终都被认为是肝素类似物（Heparin-like anticoagulant）。
肝素是一类具有多变分子量的糖胺聚糖硫酸酯，较为广泛的存在于正常人体组织与细胞中，但含量微小。正常存在的肝素，在人体内的生理作用并不明确，但一般并不发挥抗凝作用。
肝素有很多衍生和相似物，如低分子量肝素、硫酸乙酰肝素等。肝素在体内外发挥抗凝作用的机制，主要是作为辅酶与抗凝血酶结合，显著增强后者抑制凝血酶的能力。
1980年，来自梅奥诊所的研究者报道了一名罹患多发性骨髓瘤的女患者，上肢出现大血肿，同时凝血试验中TT、APTT、PT不同程度的延长。这些研究者从该患者血浆中分离、纯化出一种抗凝物。实验表明，该抗凝物的理化性质与硫酸乙酰肝素无异。他们分离出的该物质抑制凝血酶的能力，与商品肝素相似[2]。
1985年，另一组研究者，从一名存在致命性出血的多发性骨髓瘤患者体内也分离出一种抗凝物。实验表明，其成分和抗凝活性与硫酸乙酰肝素相似。该患者最终因消化道和肺泡出血死亡。他的凝血结果模式与上一名患者类似[3]。
而且，这些存在肝素类似物的多发性骨髓瘤患者，通过输血浆或血浆置换，都无法逆转他们异常的凝血结果，也无法达到止血目的[3-4]。
本文患者罹患多发性骨髓瘤，存在持续鼻出血，凝血试验结果始终明显延长，混合试验表明存在干扰物质，输入大量血浆无法纠正凝血结果。这些都与文献中相关案例吻合。因此，我们可以推定，该患者体内很可能存在肝素类似物。
需要指出的是，在多发性骨髓瘤患者出现肝素类似物的文献中，报道的凝血试验结果往往都呈现如下模式：TT延长最为显著；APTT一般中度延长；PT则轻度延长，亦或正常。
为何该患者的凝血结果是三种试验无一例外的显著延长？我们认为，这可能是由于患者体内肝素类似物的浓度较高，或者其抗凝活性强烈所致。
有学者报道了一例华氏巨球蛋白血症患者，其TT与PT均无凝固，APTT 85秒，与我们的结果相似[5]。在除多发性骨髓瘤外的多种疾病患者体内，都发现过肝素类似物。
一般而言，如果因不当采血等原因导致凝血标本混入肝素时，通常会出现APTT与TT假性延长，而PT与FBG则不受干扰。我们做的混合试验表明，TT和APTT更容易受到干扰，也佐证该干扰物质很可能是肝素类似物。
FBG能够抵抗肝素干扰的原因，我们上面已经说了。PT不受少量肝素影响，是因为商品PT试剂中含有肝素中和剂（比如聚凝胺），可以抵抗一定量肝素的干扰。
但是，面对大量肝素时，PT试验也无法幸免。我们曾将一只绿帽采血管中的肝素，全部加至一份血浆中。再次检测时，原本都正常的凝血五项，成了如下模样。这也可以用来印证该患者的凝血结果。
大量肝素对凝血结果的干扰
虽然多发性骨髓瘤并不是罕见病，但多发性骨髓瘤患者体内出现肝素类似物却是十分罕见的情况[6]。检索相关中文文献，我们并没有发现，提及多发性骨髓瘤患者体内出现肝素类似物的文章。虽然一些中文文献报道了类似本文的案例，但这些文献中，对于反常凝血结果的成因、解释往往是含混或错误的。
有学者报道了一例多发性骨髓瘤患者，她存在持续出血，凝血试验APTT明显延长、TT与PT延长。同时，她的XI与IX因子活性显著降低，狼疮抗凝物阳性。他们认为，患者凝血功能异常和出血是获得性XI与IX因子缺乏，以及狼疮抗凝物所致[7]。但是，我们仔细分析会发现，这种解释是不正确的。
因为，在PT与TT检测中恰好不涉及缺乏的那两个因子，也就无法解释它们的延长。狼疮抗凝物的存在，依然无法解释延长的TT。
如果我们用肝素类似物，则可以很好的解释那位患者的所有凝血结果。同时，她明显降低的两个凝血因子以及狼疮抗凝物阳性，很可能是肝素类似物导致的假象[4,8]。通过稀释后再检测凝血因子，应该可以还原真相。
最后，对于存在或高度怀疑存在肝素类似物的多发性骨髓瘤患者，如果出血不能停止，可以考虑输注硫酸鱼精蛋白[6]。当然，尽快规范治疗多发性骨髓瘤本身、减轻肿瘤负担，才是治本之道。
▌进一步的实验验证
在得知患者血浆中很可能存在肝素类似物后，我们想进一步验证这个猜想。文献中一般通过在标本血浆中加入硫酸鱼精蛋白，使延长的TT试验得到纠正，来印证肝素类似物的存在。
硫酸鱼精蛋白是一种肝素中和剂，但我们手头没有该物质。通过进一步思考和查阅文献，我们发现聚凝胺不仅被添加到商品PT试剂中，作为血浆中可能出现的肝素的中和剂，也曾被研究者添加到怀疑受到肝素污染的血浆中。如果添加后，APTT结果明显缩短，就可以证明样本受到了肝素的污染[9]。
恰好交叉配血试验会用到0.05%的聚凝胺溶液。因此，我们决定以此溶液，作为肝素类似物的中和剂。
此时，该患者已经住院12天了。经过一周的化疗，他的球蛋白已降至87g/L。凝血结果也有很大改善：PT 16.5秒、TT 34.3秒、APTT不凝固、纤维蛋白原 2.3g/L。
我们选择TT观察聚凝胺溶液能否纠正患者的结果（未做PT和APTT的原因见文末注释）。
实验的一般步骤如下：在500微升血浆中，加入50微升0.05%聚凝胺的生理盐水溶液，混合均匀后（血浆中聚凝胺的浓度约为50mg/L）上机检测TT（表4）。
表4 不同标本加入聚凝胺溶液前后的TT结果（单位：秒，参考区间 14-21秒）
注：a 此实验中加入了100微升聚凝胺溶液，b 此实验中标本来自入院第13天，加入了150微升聚凝胺溶液，c 此实验中标本来自入院第13天，400微升血浆与40微升生理盐水混合。
观察以上实验结果，我们可以看到，加入聚凝胺溶液，对于正常标本的TT并不会产生任何影响，不存在稀释或者基质效应（实验1）。对于明确有肝素污染的标本，加入聚凝胺溶液，可以扭转乾坤，得到可信的TT结果（实验2）。
对于该患者的标本，单纯加入生理盐水，并不能纠正TT（实验6）。加入聚凝胺的生理盐水溶液，却可以让TT得到纠正；但纠正的并不彻底（实验3）。
提高聚凝胺在血浆中的浓度，TT的缩短幅度可以进一步提升，但依然不能完全纠正TT（实验4和5）。似乎聚凝胺对肝素类似物的中和效果存在某种“瓶颈”。
我们认为，这种现象可能是因为患者血浆中肝素类似物的抗凝活性较高，或者此物质的结构与普通肝素存在较大差异，从而无法被聚凝胺很好的中和（文献中并无聚凝胺中和肝素类似物的报道）。
不过，根据《全国临床检验操作规程》等书籍，只要在TT纠正试验中，结果能够缩短5秒以上，就可以断定存在肝素或肝素类似物[10]。如此来看，我们实验的结论是肯定的——该患者体内存在肝素类似物。
此外，对于TT纠正试验，文献中历来只有两种——甲苯胺蓝或鱼精蛋白纠正试验。但这两种肝素中和剂，在一般检验科中无法获得。而聚凝胺溶液在检验科中普遍易得。上面我们的实验表明，聚凝胺纠正试验，可以成为TT纠正试验的新范式。
结语
面对多发性骨髓瘤患者出现的反常凝血结果，我们以“分析结果→初步验证→文献检索→再次验证”的步骤，较为圆满的解释了患者的凝血结果，找出了造成反常结果的“元凶”，助力临床医生的判断。这一理论分析与实验验证相互交替的流程，也可以用到其他异常检验结果的解读中。
当面对反常、罕见的凝血结果，难以用常见原因、经验解释时，检验人和临床医生应该仔细斟酌、集思广益。而不能轻率的得出错误结论，或是陷入不断复查的怪圈中。正确的解读凝血试验结果，不仅能节约医疗资源，更是助力患者临床诊疗的福音。
致谢：感谢孙学廷老师在文献检索中给予的宝贵支持。
注释：
直接在血浆中加入聚凝胺溶液，再做APTT试验，会使结果明显延长。想要获得满意的结果，需要在血浆与APTT试剂混合后，再加入聚凝胺溶液。这需要更改全自动凝血分析仪的检测程序。
血浆中加入较高浓度的聚凝胺溶液，会使PT试验结果延长。患者此时的PT结果已接近正常，再加入聚凝胺溶液，处理后的PT结果无法区分是否存在肝素类似物。
参考文献：
[1] Coppola A, Tufano A, Capua M，et al. Bleeding and Thrombosis in Multiple Myeloma and Related Plasma Cell Disorders. Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 2011, 37(8):929-945.
[2] Khoory M S, Nesheim M E, Bowie E J, et al. Circulating heparan sulfate proteoglycan anticoagulant from a patient with a plasma cell disorder. The Journal of clinical investigation, 1980, 65(3):666-74.
[3] Palmer R N, Rick M E, Rick P D, et al. Circulating heparan sulfate anticoagulant in a patient with a fatal bleeding disorder. New England Journal of Medicine, 1984, 310(26):1696-9.
[4] Shen H, Wu C, Chen L, et al. Acquired heparin-like anticoagulation process in a patient with multiple myeloma: a case report and literature review. Translational Cancer Research, 2020, 9(11):7366-7371.
[5] 邢昕, 刘漪, 周晨晨. 一例凝血结果异常的揭秘之旅. 检验医学微信公众号，2023-6-16.
[6] Ayalew T, William L N, Bowie E J W. Circulating heparin-like anticoagulants: report of five consecutive cases and a review. American Journal of Medicine, 1990, 88(2):184-188.
[7] 于洋, 王轩，包芳等.多发性骨髓瘤并获得性凝血因子Ⅺ及Ⅸ缺乏首例报告.临床误诊误治, 2011, 24(12):51-53.
[8] 中国研究型医院学会血栓与止血专业委员会. 狼疮抗凝物检测与报告规范化共识.中华检验医学杂志, 2024, 47(02):129-135.
[9] Tientadakul P , Kongkan C , Chinswangwatanakul W .Use of an automated coagulation analyzer to perform heparin neutralization with polybrene in blood samples for routine coagulation testing: practical, rapid, and inexpensive. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 2013, 137(11):1641-1647.
[10] 尚红, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程，第4版. 北京：人民卫生出版社，2015: 106.
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