牛乳中含有丰富的营养物质，同时也是微生物生长的优良培养基。嗜冷菌通常被定义为最适生长温度在15 ℃左右、最高生长温度低于20 ℃、最低生长温度为0 ℃左右的微生物，其种类复杂，广泛分布于土壤、水、空气中。研究表明，生乳中最常见的嗜冷菌是假单胞杆菌属，其次是不动杆菌属和乳球菌属等。在低温环境下，嗜冷菌通过调节细胞膜的流动性、产生抗冻蛋白、冷休克蛋白、冷活性酶4 种途径，保持自身在低温条件下的活性，使乳及乳制品腐败。
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的吴杰、郑楠、孟璐*等从嗜冷菌的菌群及其产的耐热酶两方面综述国内外乳中嗜冷菌检测和分析的常用方法。
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乳中嗜冷菌菌群的研究与分析方法
1.1 传统平板培养法
依赖于微生物培养的检测方法是在现代分子生物技术出现之前分析微生物的唯一方法，通过对微生物形态特征、革兰氏染色、生理生化反应等方面的检测对目标微生物进行鉴定。我国标准NY/T 1331—2007《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》、SN/T 2552.4—2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第4部分：嗜冷微生物菌落计数》和国际标准ISO 17410:2019《食品链微生物学 嗜冷微生物计数的水平方法》中针对液体乳共提出了两种嗜冷菌的计数方法，分别为6.5 ℃培养10 d后计数和21 ℃培养25 h后计数，并且ISO 17410:2019中提出21 ℃培养25 h可以替代6.5 ℃培养10 d，两种方法培养得到的嗜冷菌种类不同，但鲜有研究讨论这两种温度培养得到的微生物种类差异。6.5 ℃培养法过于耗时，与生产实践脱节，应用的可能性极低，而21 ℃培养法耗时短；但21 ℃培养法与6.5 ℃培养法之间相关性仍不明确。有研究认为这两种方法得到的计数结果存在显著差异、无相关性，也有研究认为这两种培养方法之间存在极佳的线性关系，目前研究者们对这种相关性的看法不一。21 ℃培养法是否能在实践中应用以及如何应用仍需进一步的研究。
传统平板培养法目前仍然是检测生乳中嗜冷菌的通用方法。但这种方法只能对可培养微生物进行分析，缺少分析不可培养微生物的手段；并且其实验结果易受培养基、操作人员、培养环境等非样品因素的影响，变异性强、可重复性差。因此，培养法不能对乳中存在的嗜冷菌进行全面分析，需要开发其他的检测技术。
1.2 现代分子生物学检测技术
随着科技的不断发展，一些高特异性、高灵敏性的新技术逐步应用于生乳中微生物的检测，以保障乳及乳制品的质量安全。与传统方法相比，现代分子生物技术可以对微生物的基因及基因组进行分析，准确、全面地得到样品中微生物群落组成结构；对于一些不可培养或丰度低的微生物，可以通过高通量测序技术进行分析，极大地提高了检测的准确性与灵敏度。
1.2.1 聚合酶链式反应（PCR）及其衍生技术
PCR是一种在体外选择性扩增特定DNA片段的分子生物学技术，具有简单、便捷、特异性强、灵敏度高等特点，广泛应用于食品中微生物检测。步雨珊等以aprX基因为靶标，应用PCR技术建立生乳中荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）检测体系，该体系只对荧光假单胞菌基因组呈阳性反应，特异性强、检出限低。
研究者们基于PCR实验原理，通过改变扩增引物、反应温度、缓冲液等条件开发了许多衍生技术。实时荧光定量PCR（qPCR）克服了常规PCR需要琼脂糖凝胶电泳检测实验产物的缺点，通过检测特定探针或染料的荧光信号在整个反应过程中实时追踪PCR产物的形成情况。
多重PCR（mPCR）检测过程中使用了多组特定引物，能够同时对多个目的基因进行检测。Maier等基于aprX基因和rpoB基因开发了一种由2 个三重qPCR检测体系组成的方法；rpoB基因用于检测总假单胞菌数；通过对aprX基因的系统发育进行分析，将7 株不同的假单胞菌分为5 种，结合腐败潜力将5 种假单胞菌分成两类，实现了对生乳中总假单胞菌和7 种常见且具有腐败能力假单胞菌的同时定量，并且能够区分不同腐败潜力的假单胞菌，qPCR法得到的总假单胞菌计数结果与培养法得到的计数结果之间具有良好的一致性。
液滴数字PCR（ddPCR）被称为第三代PCR，能得到目标核酸序列的绝对定量结果，为临床微生物学带来了巨大的变革。该技术是将PCR的混合物分成若干小体积的液滴，每个部分进行单独的扩增反应，使用Poisson分布统计分析阴性和阳性液滴的比例，计算目标DNA分子的精确浓度，实现样本中目标序列的绝对定量。Basanisi等基于IS1111插入序列和icd基因，运用ddPCR技术检测413 个生乳和奶酪样品中的贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii），共得到78个阳性样品，其中IS1111序列的检出限为0.35 copies/μL，icd基因检出限为0.56 copies/μL。但目前ddPCR仪器和耗材的成本较高，限制了其应用，并且定量高浓度DNA样品时结果可能不准确。
PCR检测中以遗传物质DNA为模板，DNA的稳定性极强，即使细胞死亡也不会受到影响，因此PCR技术无法区分活细胞和死细胞。叠氮溴化丙锭（PMA）具有膜通透性，可以选择性地穿过细胞死亡后受到损伤的细胞膜，并与DNA分子发生共价交联，阻止死亡细胞中目标DNA的扩增。因此，PMA与PCR技术的结合可以用于确定样品中活菌的数量。
1.2.2 测序技术
测序技术是测定核酸或氨基酸等生物分子序列的技术，自1977年Frederick Sanger团队提出第一代测序方法（Sanger法）后，至今已经发展到第三代。第一代测序的主要特点是测序长度较长、准确度高，但通量低，大批量应用时成本较高。由于一代测序的准确度高于二代和三代测序，其在低通量的研究中被广泛应用，如PCR产物测序、分型分析等。通过测序能够对乳中存在的嗜冷菌种类进行全面解析。
第二代测序技术（NGS）即高通量测序技术，以454焦磷酸测序、Illumina NGS测序以及SOLiD高通量测序为代表。苟萌等利用Illumina MiSeq高通量测序技术对细菌16S rDNA V4～V5区测序，探究生乳在4 ℃冷藏过程中的细菌群落及其演替规律，发现不动杆菌属、乳球菌属、黄杆菌属（Flavobacterium）和假单胞菌属是优势菌属，为生乳的冷藏提供了基础数据。
与第二代测序相比，第三代测序实现了单分子测序，拥有超长的测序长度，能将微生物定位到种水平。梁丽姣等通过三代单分子实时（SMRT）测序法探究北京和内蒙古两地生乳的菌落组成和多样性，发现假单胞菌、不动杆菌、乳球菌是大部分样品中相对丰度最高的微生物。Du Bingyao等通过传统平板培养法和SMRT测序技术分析黑龙江、内蒙古等地生乳中嗜冷菌组成及多样性，分离得到的嗜冷菌由21 个属和59 个种组成，其中假单胞菌属占总属数的58.9%，其次是寡养单胞菌（Stenotrophomonas）和肠球菌等，固氮假单胞菌（Pseudomonas azotoformans）、副乳假单胞菌（Pseudomonas paralactis）、乳酸假单胞菌（Pseudomonas lactis）等在种水平占比较高。
16S rRNA基因编码原核生物核糖体小亚基rRNA，广泛存在于所有原核生物中。基于16S rRNA基因特定区域的测序技术可以研究样品中微生物群落组成和相对丰度，结合SMRT等第三代测序技术能实现更精确的菌落组成鉴定。吕倩等采用16S rRNA高通量测序技术测定健康奶牛和患乳房炎奶牛乳汁微生物的16S rRNA V4区序列，发现克雷伯氏菌（Klebsiella）和埃希氏菌（Escherichia）是引起奶牛乳房炎的优势菌属。该研究分离得到的优势菌属中有链球菌、假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、棒状杆菌（Corynebacterium）、梭菌（Clostridium）、嗜冷杆菌7 个嗜冷菌属，占总相对丰度的30%以上。
宏基因组测序技术可以直接从样品中提取总DNA，避开传统微生物培养这一步，对可培养和不可培养的微生物进行同步分析，并且可以将微生物注释到种乃至菌株水平。王媛媛通过Illumina Hiseq Xten测序平台对生乳微生物进行宏基因组学分析，发现不动杆菌、链球菌、无浆体属（Anaplasma）、黄杆菌、假单胞菌、乳球菌在4 ℃冷藏6 d的条件下逐渐演替，揭示了冷藏过程中微生物的演替变化规律。
全基因组测序在了解微生物进化、系统发育等方面发挥重要作用。Beno等通过全基因组测序和BLAST软件的平均核酸相似度比较对1 228 株来自乳及乳制品和牧场环境样品的芽孢杆菌分离株进行了分析，发现这些分离株来自21 种不同的芽孢杆菌，气味性类芽孢杆菌（Paenibacillus odorifer）是优势菌种。
1.2.3 荧光原位杂交
荧光原位杂交是一种应用非放射性荧光物质、基于碱基互补配对原则与待测样品中单链核酸结合，形成可被检测杂交双链的技术。Yamaguchi等通过多色荧光原位杂交结合基于16S rRNA序列的寡核苷酸探针检测乳中有活性的肠杆菌和假单胞菌，该方法与培养法的检测结果相似，并且实验程序相对简单，可用于快速检测乳中具生长潜力的肠杆菌活菌和假单胞菌。
荧光原位杂交的应用场景十分广泛，通过多色荧光原位杂交可实现对多序列的检测。但其操作步骤繁琐、信号易丢失，且不能进行定量检测。
1.3 流式细胞术
流式细胞术利用激光对液流系统中的细胞标记物进行分析，可同时测量单个细胞的多个参数，通过改变荧光染料可以对DNA、蛋白质、脂质进行定量分析，评估酶活性、细胞膜完整性等。Holm等通过使用两种荧光染色剂和两种模式的激光散射信号检测散装罐生乳中分别与不良卫生条件、嗜冷微生物、乳腺炎相关的微生物，该方法可判断生乳中主要微生物污染的类型，为牧场消除污染源提供参考。为了降低经典流式细胞术的假阳性率及非特异性信号产生的不确定数据，Wnuk等通过与荧光显微镜结合的成像流式细胞术以及吖啶橙染色鉴定和区分牛乳中的8 种微生物，并用市售样品进行验证，结果表明基于成像流式细胞术的微生物分析可用于牛乳样品中特定微生物的快速筛选。
采用流式细胞术检测乳中微生物时，样品前处理方式、缓冲液和荧光染料的选择都会影响检测结果的准确性，并且样品处理和数据分析对检测人员的要求较高，难以在牧场环境下应用。
1.4 生物传感器
生物传感器使用抗体、适配体、核酸、酶等作为生物识别元件，通过检测系统将识别结果转换为可视的光信号、电信号等，可实现灵敏、快速、成本低廉、便携和基于现场的检测。Bai Xuekun等将氨苄西林功能化磁性纳米颗粒、抗体标记的金属有机框架包封葡萄糖氧化酶以及辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的反应相结合，建立了基于智能手机和血糖仪的双模式生物传感器现场检测单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes），并在湖水和果汁等多个真实样品中进行了应用。
通过生物传感器可实现现场检测，但目前生物传感器的使用多局限于实验室中，还存在样品前处理复杂、成本较高、稳定性较差等问题，限制了其在牧场环境中的应用。
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乳中嗜冷菌产耐热酶的检测与分析方法
在生乳存放过程中，微生物的生长不可避免。经过热处理之后，生乳中病原微生物如结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、贝氏柯克斯体、芽孢等被杀灭。但假单胞菌等嗜冷菌不能被完全杀死，在巴氏杀菌乳中仍能被检测到，并且UHT处理也不能完全灭活由嗜冷菌在低温环境中产生的耐热蛋白酶和脂肪酶，其在乳及乳制品中保持70%左右的活性，是影响乳品质的直接因素。这些耐热酶在长时间贮存过程中分解乳中的蛋白质和脂肪，降低乳及乳制品的品质，使其加速腐败。UHT乳的货架期一般在180 d左右，受到的影响尤为突出。目前，针对脂肪酶的报道较少，大多数研究集中在蛋白酶上。
2.1 蛋白酶
乳中嗜冷菌产生的耐热蛋白酶分为胞内、胞壁和胞外，均会对乳品质造成影响，目前的研究主要集中于胞外蛋白酶，尤其是假单胞菌产生的胞外酶。这些酶主要影响酪蛋白组分，导致形成凝胶或产生苦味。1998年，Liao等首次报道了由荧光假单胞菌产生的金属胞外蛋白酶的生化性质和遗传特征，并将这种酶命名为AprX。深入研究发现，aprX基因编码表达AprX蛋白酶，位于假单胞菌aprX-lipA操纵子的5’端（图1）。大量研究表明假单胞菌分泌多种蛋白酶中，AprX是导致牛乳变质唯一或主要的相关蛋白酶。研究者认为，aprX-lipA操纵子的结构会影响AprX蛋白酶的水解潜力，造成不同菌株腐败能力上的差异。
在关于蛋白酶检测的相关研究中，靶向aprX基因的分子检测仍然是一个重要手段。LAMP是一种新型的核酸扩增技术，能够在等温条件下高特异性、高灵敏度地快速扩增，无需昂贵的仪器，广泛应用于微生物检测。Hu Lianxia等基于aprX和gyrB基因设计靶向引物，通过实时LAMP技术鉴定16 株荧光假单胞菌和34 株非荧光假单胞菌的DNA，当测试结果均为阳性即为荧光假单胞菌；结果表明所建立的方法具有良好的稳定性和重复性，并且消除了鉴定的假阳性和假阴性结果。
除了靶向基因的分子技术外，还有一些研究者设计了基于AprX蛋白酶及其活力的检测体系。Stuknytė等通过酪蛋白酶谱鉴定从生乳中分离得到的荧光假单胞菌产生的蛋白酶，确定分子质量约为15 kDa的蛋白水解条带产生AprX蛋白酶。Volk等建立了一种间接ELISA方法检测生乳中假单胞菌产生的AprX。这种检测方法可以在8 h内完成，检出限为7.21 ng/mL，定量限为25.7 ng/mL。UHT乳腐败过程中产生的凝胶是由AprX水解κ-酪蛋白引起，在这个过程中蛋白酶特异性切割κ-酪蛋白的Phe 105 -Met 106 键，释放C端酪蛋白巨肽（CMP）。
除假单胞菌外，沙雷氏菌也被认为具有高度的腐败潜力，是耐热酶的生产者。根据相关研究，液化沙雷氏菌产生胞外的耐热金属蛋白酶Ser1和Ser2，其中Ser1鲜见报道；Ser2由ser52基因编码，耐热性与AprX相似，具有水解酪蛋白活性，研究主要集中于该蛋白酶的生化特征、动力学参数、对乳的水解腐败潜力等方面，鲜有检测方法开发的相关研究。
2.2 脂肪酶
关于嗜冷菌脂肪酶的研究比蛋白酶少得多，一方面由于牛乳组成复杂，脂肪酶的检测结果不准确；另一方面由于乳中脂肪酶含量低，需要很高的检测灵敏度。嗜冷菌产生的脂肪酶经过UHT处理仍保持20%～30%的活性，被认为是导致乳发生酸败、产生异味的主要原因。目前，文献报道产生脂肪酶的嗜冷菌有假单胞菌、不动杆菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌、气单胞菌（Aeromonas）、无色杆菌（Achromobacter）等。Xin Liang等通过实时LAMP技术检测生乳中产脂肪酶的荧光假单胞菌，发现在纯培养中LAMP技术的检出限为4.8×101 CFU/反应，低于PCR法的4.8×102 CFU/反应。
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结 语
随着技术的发展，微生物的相关研究越来越深入，PCR方法和测序技术帮助研究者从不同方面了解微生物。通过测序技术，乳中存在的微生物被大量解析。通过研究这些生活在乳中微生物的生理特性、致病性、腐败能力、丰度以及风险位点等，危害性高的微生物被重点关注。在牧场中，控制奶杯、药浴杯、乳头、饲料、垫料、奶罐、运输器具等的卫生条件有利于减少乳中的微生物污染；经过热加工后，危害严重的致病菌被杀灭，乳中的微生物数量大幅度降低。因此，受热加工影响较小的嗜冷菌及其产生的耐热酶成为影响乳及乳制品安全的主要因素，关于这类微生物检测技术的开发也成为保障食品安全的重要手段。
目前检测嗜冷菌菌群的方法多是基于假单胞菌或荧光假单胞菌等某些假单胞菌，鲜见针对其他属或是针对总嗜冷菌检测方法的开发。一方面由于假单胞菌及荧光假单胞菌被一致认为是影响乳品质的最主要菌种，关于其分类、腐败能力、检测等的研究比较清晰；另一方面是因为乳中嗜冷菌菌群分离鉴定的研究仍在进行中，对于除假单胞菌之外的嗜冷菌需要更多的研究。但这些检测方法主要是在实验室进行，无法在牧场等生产环境中展开，且缺乏快速检测的标准方法。对于最直接影响乳品品质的耐热酶，假单胞菌产生的AprX研究最多，也有少量关于沙雷氏菌产生Ser2的研究，但乳中分离得到其他嗜冷菌是否会产生其他的耐热蛋白酶或脂肪酶仍未可知，且对于耐热酶耐热机制的认识仍不清晰。
乳中嗜冷菌的存在已经成为不可避免的事实，如何控制嗜冷菌及其耐热酶对乳品质的影响成为乳业领域的一大挑战。随着对嗜冷菌研究的深入，明确乳中存在的嗜冷菌及其耐热酶对乳品质的具体影响，建立快速的嗜冷菌现场检测方法对提高乳品品质有重要意义。
本文《乳中嗜冷菌检测和分析方法的研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷13期356-364页. 作者：吴杰，郑楠，王加启，孟璐. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230614-119. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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