甲壳类水产品与鱼、牛奶、鸡蛋等食物被世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织认定为最易过敏的八大类食物。食品在加工过程中经历的加热、剪切等物理作用,以及组分之间内源性的化学作用,均会影响食物的致敏性。因此,低致敏性食品加工方式已成为当前的研究热点。甲壳类水产品中含有大量优质蛋白质,氨基酸的游离氨基或氨基酸残基和还原糖的羰基在食品加工或长期贮藏时形成共价键,为美拉德反应(MR)的发生提供了前提。MR又称羰胺反应,是指发生在羰基化合物和氨基化合物之间的非酶褐变反应,广泛应用于改善食品色泽和风味相关的食品加工行业中;研究表明其可影响甲壳类水产品的致敏性,但因其反应的复杂性、晚期产物中可能存在有害产物等因素,也制约了其在水产食品工业中的应用。
集美大学海洋食品与生物工程学院刘萌、刘光明和澳门大学社会科学学院姚有容等首先对MR方法进行系统介绍,同时,从结构和抗原表位的角度阐述甲壳类水产品致敏原的研究进展;在此基础上,着重对甲壳类水产品致敏原经MR处理后致敏性变化及其作用机理进行综述。旨在为MR用于甲壳类水产品致敏原致敏性控制与消减提供参考。
01
MR法
MR主要有干热法和湿热法2 种。早期的MR均为干法,其特点在于蛋白质和还原糖先经冻干处理,低温(50~60 ℃)下混合即可发生MR。此方法操作简单,但存在明显的缺点,蛋白质和还原糖需要分别冷冻干燥,明显延长了整个MR的时间;反应需严格控制反应容器的湿度,也进一步增加了MR的工业化应用成本;此外,反应过程中没有额外溶剂的存在,反应物蛋白质和还原糖可能接触不充分,进而影响MR的效果;产物混合后数天至数周的反应时间进一步消耗了反应物中的游离氨基酸,增加了MR产物的复杂性,不利于食品营养品质。因此,干法短时和湿法MR逐渐受到国内外学者的青睐。干法短时是将干法MR反应时间控制在数小时之内,湿法MR在一定pH值的缓冲液中进行,增加了反应物的接触,有助于反应温度的提高,因此所需的反应时间大大缩短;但液体状态下的反应产物在工业生产中的运输存在一定限制,也影响了其在工业上的大规模应用。
此外,超声波、辐照、脉冲电场等非热加工方式辅助MR的相关研究也越来越多,表1详细总结了不同类型MR方法的优劣。超声波处理产生的空化效应所形成的能量及高温有助于提高MR中晚期的速率,并且具有改善产物溶解性和乳化性的潜力。虽然超声辅助MR可有效改善食品的性质,但过高的超声功率可能会产生一些有害成分,如丙烯酰胺和5-羟甲基糠醛,因此,实际使用时,需先依据具体的反应物质探究其适宜的反应条件。微波处理时的偶极极化和离子传导产生大量热量,引起蛋白质结构及二硫键、氢键等非共价键的破坏,此外,微波处理还可以通过解开碳链以促进多糖分子的重排和相互作用,进而影响MR的发生。脉冲电场处理也是一种新兴的非热食品加工技术,其在改变生物大分子微观结构和相互作用方面具有较大的潜能,MR反应物经脉冲电场处理后,蛋白质二级结构部分展开,暴露出一些隐藏的疏水基团、巯基等;同时多糖链发生解聚,分子间反应概率增加,有助于MR的进行。虽然超声波等新型MR辅助方法在甲壳类水产品加工工业应用中还存在一定的局限性,但它们具有反应效率高、反应时间短等优点。因此在了解其作用机制的前提下,如何控制MR反应条件以改善蛋白质性质仍然值得进一步探究。
当前甲壳类水产品致敏性的相关研究多集中在干法MR对其致敏原致敏性的影响,也有部分报道表明湿法MR可有效降低甲壳类水产品致敏原致敏性,其作用机理主要包括对致敏原结构和抗原表位的影响。对于甲壳类水产品致敏原种类、结构和抗原表位的研究,有助于低致敏性MR加工方式的探究及其在工业上的推广和应用。
02
甲壳类水产品致敏原结构及抗原表位
致敏原的存在是引起甲壳类水产品过敏的主要原因,目前已经被鉴定的甲壳类水产品致敏原主要来自EF手型的钙离子结合蛋白家族、肌动蛋白结合蛋白家族和磷酸原激酶家族,且多集中于肌肉等可食部分。从种类来看主要有包括原肌球蛋白(TM)、精氨酸激酶(AK)、肌球蛋白轻链(MLC)、肌质钙结合蛋白(SCP)和磷酸丙糖异构酶(TIM)等在内的47 种致敏原被WHO/国际免疫学会联合会(IUIS)数据库收录并命名(表2)。
已报道的甲壳类水产品致敏原分子质量多为10~100 kDa,这一点与致敏原在机体内的消化及免疫系统的识别相关。甲壳类水产品致敏原中普遍存在较为稳定的结构或序列,以确保其经历食品加工处理及机体消化后仍能被免疫系统识别,引起特异性免疫反应,因此,研究其结构或稳定的序列是明确食品加工处理对其致敏性影响的前提 。
2.1 致敏原结构
表3总结了目前已报道的甲壳类水产品致敏原晶体结构的相关信息。
TM属于肌动蛋白结合蛋白家族,是与肌动蛋白结合并调节肌钙蛋白和肌凝蛋白相互作用的螺旋状蛋白质,2 条α-螺旋相互缠绕而成的空间结构增加了其结构稳定性,使其经高温、高压等加工处理后仍能保持较强的致敏性。但囿于TM线状结构,无法长成适合X射线衍射的晶体形状,甲壳类TM的相关晶体结构报道较少。
AK是可催化磷酸基从ATP可逆转移到精氨酸的激酶,其空间结构较为复杂,甲壳类中仅有Lit v 2(PDB:4AM1)和Scy p 2(PDB:5ZHQ)的晶体结构被报道。AK的N端含有多个α-螺旋组成的α-螺旋结构域,C端的α-β结构域含有多个不同的α-螺旋和β-折叠,其致敏性变化与空间结构的关联较大。
MLC属于EF手型家族,在机体内可调节平滑肌的收缩,其空间结构以α-螺旋为主,具有较好的耐热、耐消化特性,其晶体结构报道较少。
SCP是典型的EF手型钙离子结合蛋白,具有较好的耐热、耐消化特性,甲壳类中仅有Scy p 4(PDB:7WBO)的晶体结构被报道;Scy p 4的晶体结构证实了它是一个球状分子,该结构包括9 个α-螺旋,约占结构的61%。2 个相邻的α-螺旋和连接环构成了螺旋-环状-螺旋的EF手型基序。
TIM是糖酵解中的关键酶,在机体的代谢中发挥了重要作用,其一级、二级结构保守性较高,甲壳类中仅有
P. vannamei中的TIM(PDB:5EYW)[41]和Scy p 8(PDB:6JOX)的晶体结构被报道。其结构中主要包括由多个中心β-链和多个环连接的α-螺旋组成的(β/α)8桶状结构,活性位点通常位于β-链,位于具有βα环的桶状结构的C端。
此外,甲壳类水产品致敏原中90 kDa的细丝蛋白C(Scy p 9,PDB:7VZO)的晶体结构也已经被报道[34],其属于丝蛋白家族,三级结构为具有免疫球蛋白样褶皱的二聚体,单体为由16 个β-链和2 个α-螺旋组成的桶状结构;结构域之间含有保守区域。
结构解析是明确其致敏性差异的基础,但蛋白质本身是否能结晶、结晶条件的摸索和优化不易、晶体结构解析难度大等因素,使得甲壳类水产品致敏原晶体结构解析进展缓慢。甲壳类不同物种间的致敏原序列同源性较高,SWISS-MODEL、AlphaFold2等生物信息学软件可基于已知蛋白质结构,借助同源建模方法或氨基酸序列同源性分析等预测蛋白质三维结构,为甲壳类水产品致敏原的结构研究提供了新的思路。
2.2 致敏原抗原表位
食物致敏原的实质是具有多个IgE结合表位的蛋白质,致敏原的致敏性主要取决于其IgE结合表位,IgE结合表位按其空间结构特点可分为线性表位和构象表位。线性表位是指一级序列上连续的氨基酸,具有较强的耐加工、耐消化特性。构象表位是蛋白质空间结构上邻近的氨基酸,这部分表位对其空间结构依赖性较强,易受加工热处理和胃肠道消化的影响而不稳定,因此国内外学者对甲壳类水产品致敏原抗原表位的研究普遍集中在线性表位上。已具有IUIS系统命名的龙虾致敏原抗原表位主要集中在小龙虾(
P. clarkii)中, AK 的 6 个线性表位、 MLC 的 4 个线性表位和 5 个构象表位区域、 TIM 的 5 个线性表位已经先后被鉴定(表 4 )。蟹类食物致敏原的抗原表位主要集中在青蟹(
S. paramamosain)中,青蟹 AK 、 MLC 、 SCP 和 TIM 等致敏原的相关表位也陆续被鉴定(表 4 )。目前来看,虾类食物致敏原的抗原表位主要集中在
L. vannamei中, TM 、 AK 、 MLC 和 SCP 的抗原表位均已被鉴定;此外,其余虾类食物中,如
E. modestus
M. ensis,抗原表位的相关研究均集中在主要致敏原 TM 中。表 4 总结了甲壳类水产品致敏原已被鉴定的线性表位 和构象表位。
致敏原线性抗原表位的定位主要有重叠肽技术、抗原抗体复合物共结晶技术、噬菌体展示技术、OBOC筛选技术等实验检测方法。
相比于传统的实验检测方法确定抗原表位,多种生物信息学软件联用可以快速且有针对性地预测潜在的抗原表位。
此外,食品过敏原构象表位可引起口腔过敏综合征,但考虑到构象表位的不稳定性和致敏原晶体结构的匮乏,甲壳类水产品致敏原构象表位的研究方法以噬菌体展示技术、OBOC筛选技术等方法为主。
甲壳类水产品致敏原抗原表位的研究多集中在主要致敏原TM中,且当前抗原表位多以线性表位为主。单一方法定位抗原表位存在检测率及准确性等方面的局限;预测、实验验证等多种方式联用可较为全面地鉴定抗原表位,甲壳类水产品致敏原抗原表位的相关研究还需要进一步加强。
03
甲壳类水产品致敏原的MR处理
基于国内外学者目前的研究,MR可通过改变致敏原的结构,或者影响氨基酸之间的交联、以糖基化等方式化学修饰致敏原,以掩盖、暴露、形成食品致敏原抗原表位,进而影响食品致敏原的致敏性。虽然MR引起反应物结构及与IgE结合能力的变化,但其并非一定能降低致敏原的致敏性,Lit v 1与麦芽糖经MR后,其致敏性未发生显著变化。此外,不同类型的蛋白质,其致敏性本身也有较大不同,因此本文总结了已报道的甲壳类水产品致敏原经MR后的致敏性变化情况(表5)。
3.1 甲壳类TM的MR处理
甲壳类水产品致敏原的MR相关研究均集中于TM,其主要原因可能有2 个:1)TM是甲壳类中的主要致敏原,人群中致敏频率较高;2)TM的结构简单、热变性温度较高、热稳定性较好,常规热处理无法完全降低其致敏性,因此对其进行加工处理更有实际应用意义。TM致敏性降低的原因主要有:1)结构的变化:TM的空间结构以α-螺旋为主,α-螺旋的变化对致敏性影响较大;如Pen c 1、Pen a 1等发生的MR反应,致敏原二级结构中的α-螺旋解开,致敏原分子呈舒展状态,构象变化较大;2)氨基酸的修饰:具有ε-氨基的赖氨酸可以发生缩合反应,精氨酸中的胍基也已经被证明可以参与MR;TM抗原表位上赖氨酸、精氨酸、组氨酸等也是参与MR的主要氨基酸,这也是甲壳类TM致敏性降低的原因之一;Scy p 1抗原表位(R105-A116)中第112位的赖氨酸在MR中被修饰,Lit v 1中19 个赖氨酸和18 个精氨酸也被发现发生了位点修饰。此外,有学者认为不含赖氨酸或精氨酸残基的抗原表位具有较高的IgE结合亲和力,随后的研究也证明MR可以修饰组氨酸和半胱氨酸,反应发生在组氨酸中的咪唑基团,而色氨酸中的吲哚基团也可以被MR所修饰,进而影响其致敏性;3)干预免疫系统:Exo m 1与半乳糖低聚糖、甘露聚糖低聚糖和麦芽糖戊糖发生MR后,小鼠体内嗜碱性粒细胞的脱颗粒程度降低,免疫信号通路被抑制,小鼠致敏症状减弱、致敏性降低;Exo m 1与
D-葡萄糖、麦芽三糖、麦芽五糖、麦芽七糖发生MR后,糖化产物可显著影响噬碱性粒细胞KU812的激活、且肠上皮黏膜细胞Caco-2中白细胞介素8的释放被抑制,其致敏性降低。
MR中不同糖类可引起不同程度的蛋白质构象伸展或折叠,对赖氨酸等抗原表位上的氨基酸进行不同程度的修饰,从而对其致敏性起到决定性作用,但当前鲜有还原糖种类/含量与致敏原致敏性之间构效关系的相关研究。MR过程中应注意选择还原糖的类型,以避免产生抵消致敏性降低的新致敏原。
干法和湿法MR均可以降低虾蟹TM的致敏性,但已报道的MR处理时间均较短,这可能跟虾蟹高蛋白含量及丰富的营养价值有关,较短的反应时间可最大程度避免食品中营养成分的流失。
3.2 甲壳类其他致敏原的处理
青蟹过敏人群中AK的阳性率高达42.31%,远高于TM的30.77%;SCP的阳性率也高达15.38%,因此也有学者对这类过敏原进行MR处理。Scy p 2与阿拉伯糖发生MR后,小鼠的过敏症状得到显著改善,Th1型细胞因子表达升高、Th2型细胞因子表达明显下调;其致敏性下降的主要原因在于Scy p 2抗原表位中的赖氨酸和精氨酸在MR过程中发生了明显的位点修饰。Scy p 4与木糖发生MR后,蛋白微观结构变得松散,球状结构中α-螺旋解开、β-折叠含量升高,疏水性增加,IgE结合能力降低。相较于简单结构的TM,甲壳类水产品AK、SCP等致敏原具有复杂的空间结构,结构对其致敏性的影响更大,在MR过程中致敏原二级结构被破坏、表面电荷或表面疏水性发生变化,进而引起空间结构的变化,其致敏性也会随之出现明显变化。
此外,也有学者基于甲壳类水产品基质探究了MR对
L. vannamei可食部分免疫结合活性的影响及其相关机理,
L. vannamei与半乳糖在高温高压反应后,其可食部分的质构发生明显变化、可消化性提高、虾肉的免疫结合活性显著降低,其原因可能是基质中Lit v 1、Lit v 2、Lit v 3和Lit v 4抗原表位上的赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸经MR后发生了修饰。
MR可作为低致敏性甲壳类水产品加工的候选方法,其机理主要在于:1)对致敏原结构的修饰,如α-螺旋等二级结构的破坏、二硫键的修饰、疏水性改变等引起的空间结构变化;2)抗原表位上赖氨酸、精氨酸等的修饰,这种修饰又进一步引起其结构的变化,最终影响致敏原与IgE的结合。但目前的研究对于反应物(还原糖和蛋白质)与甲壳类水产品致敏原致敏性之间的构效关系研究还不足,此外,重视单一致敏原致敏性而忽视其食物基质致敏性的研究,也制约了MR的工业化应用。
结语
MR是食品加工及贮藏过程中常见的非酶褐变反应,可增加食品风味、改善蛋白质的功能特性,也可有效降低甲壳类水产品致敏原致敏性。本文首先对MR方法进行了系统介绍;同时,从结构和抗原表位的角度阐述了甲壳类水产品致敏原的研究进展;在此基础上,着重对甲壳类水产品致敏原经MR处理后致敏性变化及其作用机理进行综述。相较于干法和湿法MR,超声波等新型辅助方法展现出反应效率高、反应时间短等优点,但其在甲壳类水产品致敏性中的相关研究还较少。致敏原的结构和抗原表位对于解析其致敏性变化、开发低致敏性加工方式等具有重要意义,基于致敏原晶体结构的抗原表位解析定位是了解致敏原致敏机理的前提;但甲壳类水产品致敏原晶体结构及家族分类信息还不足。MR可降低甲壳类水产品致敏性,主要机理在于其改变了致敏原结构、修饰了抗原表位位点等,但其受致敏原和还原糖种类的影响,因此适合工业化的反应条件仍需要摸索。
在MR影响甲壳类致敏性的相关研究中还有以下几个方面亟待解决:1)进一步加强超声波等新型MR辅助技术的相关研究,控制MR反应程度,尽快实现低致敏性甲壳类水产品生产技术的工业化应用;2)甲壳类水产品的MR相关研究起步较晚、研究不深入,致敏原致敏性影响因素较多,MR与甲壳类水产品致敏性的构效关系尚不明确,基于工业化应用的角度,仍需要加大对其构效关系的解析;3)食品中的MR涉及到食物基质等的影响,但目前的研究多集中于单一致敏原的MR,难以真正全面衡量MR降低甲壳类水产品致敏性的效果,因此,基于全食品的MR研究迫在眉睫。
作者简介
通信作者:
刘光明,博士,教授,主要研究方向为水产食品加工与安全的应用基础研究。集美大学研究生院常务副院长,集美大学食品科学学术带头人,中国食品科学技术学会理事;获国家百千万人才,国家有突出贡献中青年专家;主持完成包括6 项国家自然科学基金项目在内的各类课题25 项;授予发明专利权41 项(其中第一发明人15 项);发表论文309 篇(其中第一作者或通讯作者155 篇),包括SCI期刊上发表研究论文143 篇(其中第一作者或通讯作者72 篇),获得省部级科技奖7 项(其中第一获奖人4 项) 。
第一作者:
刘萌 ,博士, 副教授 , 主要研究方向为食品质量与安全。 主持在研国家自然科学基金项目青年基金 1 项、省厅级科研项目 1 项,福建省个人科技特派员,第一作者发表与水产品加工相关中英文文献 8 篇,其中 SCI 一区 4 篇。
本文《美拉德反应影响甲壳类水产品致敏原致敏性的研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷第7期10-18页,作者:刘萌,姚有容,张建华,李颖,孙兆敏,卓泽晟,桓霏,刘庆梅,刘光明。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230926-251。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑:南伊;责任编辑:张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
热门跟贴