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Introduction
酒精性肝损伤已成为一个健康问题全球关注，根据世界卫生组织的统计数据，每年由于过度饮酒死亡的人数高达300多万。长期过量饮酒会引起酒精代谢产生活性氧在肝脏中积累造成氧化应激，造成脂肪在肝细胞中沉积。近年来，营养干预已经作为一种有效的预防手段而广受关注，已在大量天然食品中发现具有抗氧化活性的功能性物质。姜黄素是一种从姜科和天南星科的根和茎中提取的酚类活性物质，具有抗氧化、抗病毒、抗炎和其他功能活动。但姜黄素中的低水溶性、低生物利用度和较差储存稳定性，限制了其在营养和保健食品中的广泛应用。
稳态化运载体系已经被证明是实现食品功能因子高生物利用率及生理活性功能的有效方法，构建高效负载功能因子的食品载运体系已成为当前国内外食品领域的研究热点。本论文基于半乳糖的靶向，通过美拉德反应制备雨生红球藻蛋白-半乳糖偶联物（HPP-GAL），并通过乳化溶剂蒸发法制备了糖基化雨生红球藻蛋白-姜黄素纳米颗粒（HPP-GAL-CUR）。首先，雨生红球藻蛋白-半乳糖美拉德反应的程度通过褐变指数和接枝度进行监测，产生的偶联物通过傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）、紫外-可见吸收光谱、荧光光谱等进行表征；其次，探讨该体系在提高姜黄素稳定性、体外释放特性、生物利用度和在缓解酒精性肝损伤方面的效果。
图1 基于雨生红球藻蛋白-半乳糖美拉德反应产物构建姜黄素稳态化载运体系缓解急性酒精性肝损伤研究思路示意图
Results and Discussion
HPP-GAL复合纳米颗粒的制备过程如图2A所示。通过在420 nm处的吸光度变化对美拉德反应过程中的褐变指数进行监测，结果如图2B所示：在前4 h，随着美拉德反应时间的增加，褐变指数显著增加，褐变指数的增加代表二次美拉德反应产物的形成；反应5 h后，褐变指数略有下降，这可能是由于美拉德反应后期产生了副产物。图2C显示不同美拉德反应时间下HPP-GAL偶联物的糖基化程度。随着美拉德反应时间的增加，HPP-GAL偶联物的接枝度逐渐增加，在5 h达到最大值24.61%。说明半乳糖的羰基与蛋白质的氨基发生美拉德反应，形成希夫碱。褐变指数和接枝度的增加表明HPP和GAL之间发生了美拉德反应，为了尽量控制二次产物以及美拉德反应副产物的产生，将美拉德反应4 h后的HPP-GAL偶联物用于后续实验。
图2D为不同美拉德反应时间的HPP-GAL的FTIR谱图，其中3405和1075 cm-1处的特征峰属于O-H伸缩振动和C-O伸缩振动，其强度随反应时间的增加而增加，2935和2855 cm-1的特征峰强度降低，这与C-H和N-H的拉伸变化有关。此外，1647和1539 cm-1处的峰属于酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ带，这是蛋白质的特征峰，其强度明显下降，表明HPP与GAL的共价结合消耗了蛋白质的氨基。图2E为HPP-GAL偶联物在美拉德反应过程中荧光光谱的变化。可以看出，当HPP与GAL结合后，荧光发射最大值发生红移，说明美拉德反应能够使HPP的色氨酸向更亲水的环境移动，HPP的分子链伸展的更大，结构更松散，更多的显色集团暴露出来，增强了HPP的亲水性。同时，随着HPP-GAL偶联物的接枝度的增加，HPP表面有更多的GAL分子，引起了较强的空间位阻效应，从而阻断了HPP的色氨酸残基的荧光信号，导致HPP-GAL的荧光强度逐渐下降。
以HPP和HPP-GAL为载运壁材，构建负载CUR的递送体系，为获得最大包埋率，考察了CUR与HPP或HPP-GAL的比例对CUR在递送颗粒中的包埋率和负载率的影响，结果如图3C和D所示。随着蛋白比例的逐渐增大，两种原料制备的纳米颗粒的包埋率均先逐渐增大，然后下降。当姜黄素与HPP或姜黄素与HPP-GAL的比值从1:12增加到为1:18时，姜黄素的EE值分别从（36.65±0.95）%和（54.99±0.71）%增加到（76.9±0.34）%和（89.21±0.33）%。这是因为随着蛋白质质量不断增大，有更多的CUR被负载到HPP的疏水性内壳中，所以包埋率呈现上升的趋势。然而，当HPP和HPP-GAL比值的持续增加到1:21时，HPP和HPP-GAL出现过载现象，故导致CUR包封率的降低。CUR的LA值在CUR与HPP/HPP-GAL比值为1:18时达到最大值，分别为（0.43±0.01）%和（0.50±0.004）%。此外，基于HPP-GAL偶联物的递送粒子的EE和LA值均高于基于HPP的递送粒子，HPP-GAL结合物增强了EE和LA值可能是通过美拉德反应改善了HPP分子间的氢键和疏水作用力。
将游离CUR、HPP-CUR和HPP-GAL-CUR置于pH 2.0的强酸溶液中，探究HPP和HPP-GAL在强酸条件下对CUR的保护作用。从图4A可以看出，游离的姜黄素在强酸环境中迅速分解，30 min后的保留率仅为（28.36±0.02）%；在HPP-CUR和HPP-GAL-CUR颗粒中，30 min后CUR的保留率为（66.51±1.26）%和（99.06±0.83）%；3 h后，游离姜黄素的保留率仅为（12.42±0.02）%，HPP-CUR和HPP-GAL-CUR纳米颗粒仍能保留（54.91±0.43）%和（71.81±1.25）%的CUR，因此，HPP-CUR和HPP-GAL-CUR纳米粒均能有效保护姜黄素免受强酸损伤，且HPP-GAL-CUR纳米粒的保护作用强于HPP-CUR纳米粒。图4B为在不同离子强度条件下，游离CUR、HPP-CUR和HPP-GAL-CUR纳米颗粒的稳定性变化。处理24 h后，随着盐离子浓度的增加，游离CUR、HPP-CUR和HPP-GAL-CUR纳米颗粒的CUR保留率均逐渐降低。经150 mmol/L盐溶液处理后，HPP-CUR和HPP-GAL-CUR的CUR保留率分别为（52.80±0.41）%和（57.55±0.74）%，说明经过美拉德反应后的HPP-GAL-CUR的离子稳定性高于游离CUR和HPP-CUR。游离CUR、HPP-CUR和HPP-GAL-CUR的紫外稳定性如图4C所示：紫外线照射5 h后，游离姜黄素中CUR的保留率为（47.62±3.74）%，而HPP-CUR和HPP-GAL-CUR的姜黄素保留率分别为（54.02±1.21）%和（58.18±1.31）%。HPP-CUR和HPP-GAL-CUR对紫外线稳定性的提高可能与HPP和HPP-GAL中含有丰富的虾青素有关。游离CUR、HPP-CUR和HPP-GAL-CUR在高温下的稳定性变化如图4D所示，结果表明经过美拉德反应后HPP-GAL的热稳定性明显增强，可以有效的保护CUR抵抗高温的伤害。
按照图4E所示的方案研究HPP-CUR和HPP-GAL-CUR纳米颗粒在模拟胃肠道消化过程中的CUR释放特性，对应的结果如图4F和G所示。在模拟胃液中，前30 min内（15.73±0.88）%的CUR从HPP-CUR纳米颗粒中迅速释放，而HPP-GAL-CUR在30 min内的释放率仅为（4.76±0.39）%，这可能是因为HPP糖基化后形成了更加致密的结构，结构更稳固，所以不易被消化，而未被糖基化反应的HPP-CUR在胃消化初始阶段被胃蛋白酶消化了较大一部分。90 min后，HPP-CUR的CUR释放率为（17.06±0.65）%，HPP-GAL-CUR的CUR释放率为（6.08±1.12）%。与HPP-CUR相比，HPP-GAL-CUR纳米颗粒能更有效地保护CUR免受胃消化的损失。在SIF中，HPP-CUR和HPP-GAL-CUR在60 min后均表现出快速释放，释放率分别为（97.01±0.93）%和（93.12±1.37）%，说明包埋在纳米颗粒中的无定形CUR释放出来。HPP-CUR在肠道消化2 h后释放率达到（99.28±0.47）%，几乎完全释放。HPP-GAL-CUR的释放率为（97.35±1.04）%，完全释放可能需要更多的时间，表现出更持久的释放。美拉德反应的修饰提高了纳米颗粒的释放行为，这可能归因于与还原糖的美拉德反应会引发蛋白质的交联反应，减缓了纳米颗粒的释放速率。这些结果表明，HPP-GAL-CUR纳米颗粒能够实现姜黄素在胃肠道中的缓释，对CUR起到良好的保护作用，可能是疏水活性化合物的有效递送载体。
在灌胃Free-Nile red、HPP-Nile red和HPP-GAL-Nile red溶液后，各个时间点的小鼠组织器官的分布情况如图5所示。图5A为小鼠各个器官明场图片，如图5B所示，在24 h的消化过程中，Free-Nile red组和HPP-Nile red组只在胃和肠道中观察到荧光信号。而HPP-GAL-Nile red在口服6 h和12 h后均可在肝脏中观察到荧光信号，说明由于半乳糖的存在，HPP-GAL-CUR具有肝脏靶向性。通过分段时间观察不同分组的荧光强度比较发现，HPP-GAL-Nile red组相对另外两组具有明显的肝靶向性。根据图5C和D观察发现，三组胃中的荧光随着时间的推移逐渐减少；肠道中游离尼罗红的荧光强度仅在24 h后下降，而HPP-Nile red组在整个24 h内肠道中的荧光强度逐渐下降，HPP-GAL-Nile red在12和24 h肠道中的荧光强度高于HPP尼罗红，这表明HPP-GAL-CUR中CUR的释放更持久。如图5E所示，HPP-GAL-Nile red组6 h肝脏荧光信号为10.23±0.24，12和24 h分别下降为1.56±0.10和0，表明HPP-GAL-CUR纳米颗粒可以从肝脏代谢。
从小鼠肝脏切片的H&E染色结果可知：Control组小鼠的肝小叶结构完整，肝细胞致密，分布均匀，无炎症部位；酒精处理组小鼠明显可见严重的肝损伤，表现为粒细胞堆积和细胞肿胀，表明酒精破坏了肝细胞正常的脂质代谢；游离CUR处理组仍可见明显的粒细胞堆积和细胞肿胀部位，说明游离CUR不能有效缓解酒精损伤引起的肝损伤；HPP和HPP-GAL处理组明显抑制了细胞肿胀现象，但仍能观察到粒细胞堆积，说明HPP和HPP-GAL可以一定程度上改善酒精造成的炎症反应；HPP-CUR处理组中几乎观察不到细胞肿胀，只有少量的粒细胞堆积，病理损伤有明显的减轻；HPP-GAL-CUR处理组与其他预防组相比，预防效果最好，未观察到细胞肿胀和粒细胞堆积，有效缓解了酒精造成的肝损伤。
如图6H和I示，与对照组相比，酒精处理后血清中AST和ALT水平明显升高，说明急性酒精肝损伤模型建立成功。游离CUR对ALT和AST的升高无明显缓解，而HPP和HPP-GAL处理部分抑制了酒精引起的ALT和AST的升高，HPP-CUR和HPP-GAL-CUR干预有效地抑制了小鼠血清中ALT和AST活性增加。值得注意的是，HPP-GAL-CUR对血清ALT和AST升高的抑制作用是所有预防组中最好的，对酒精引起的肝脏损伤具有一定的保护作用。如图6J和K所示，与Control组相比，酒精处理后，小鼠血清中TG和TCHO浓度明显升高，游离CUR、HPP、HPP-GAL、HPP-CUR和HPP-GAL-CUR的干预均能降低酒精诱导的TG和TCHO水平升高，其中HPP-GAL-CUR对肝脏脂质积累的抑制作用最好。
如图6L所示，与Control组相比，ALD组酒精损伤导致肝脏脂质严重氧化损伤，MDA水平升高。游离CUR、HPP、HPP-GAL、HPP-CUR和HPP-GAL-CUR的干预均能抑制MDA水平的升高。相应的，酒精处理显著降低了细胞内抗氧化酶GSH、GSH-Px和SOD的活性，而游离CUR、HPP、HPP-GAL、HPP-CUR和HPP-GAL-CUR干预均能显著恢复急性酒精暴露小鼠肝脏中GSH、GSH-Px和SOD的水平，且HPP-GAL-CUR组对上述4项指标降低的抑制作用最显著。总之，与游离CUR、HPP、HPP-GAL和HPP-CUR相比，HPP-GAL-CUR纳米颗粒具有更好的抗急性酒精性肝损伤作用，这可能与HPP-GAL-CUR具有更高的抗氧化活性以及CUR的持续释放提高了姜黄素的生物利用度有关。
Conclusion
在这项研究中，雨生红球藻蛋白-半乳糖纳米复合物通过美拉德反应成功制备，并通过疏水相互作用和氢键构建姜黄素的稳态化递送体系，有效提升了姜黄素的包封效率和装载能力。雨生红球藻蛋白-半乳糖-姜黄素纳米颗粒微观形貌均呈椭球形或球形，在水溶液中具有良好的分散性，与游离姜黄素相比，在强酸环境、紫外辐射、盐溶液和高温条件下，载运体系对姜黄素的稳定性分别提高了59.39%，9.92%，24.71%，28.89%。雨生红球藻蛋白-半乳糖-姜黄素降低了姜黄素在胃酸环境的损失率，实现对姜黄素的控释和缓释，美拉德反应缀合的半乳糖残基赋予该纳米颗粒肝脏靶向特性，可通过抑制氧化应激和脂质堆积来有效缓解酒精性肝损伤，并且调节器官指数，改善酒精造成的肝细胞肿胀、粒细胞堆积、胃粘膜溶解等炎症反应。
第一作者
刘芯怡，大连工业大学食品学院2020级硕士研究生。
通信作者
程沙沙，大连工业大学食品学院副教授，目前主要从事水产食品营养与健康方面的研究，以第一作者或通信作者在Analytical Chemistry、Food Function、Food Research International、Meat Science等国际期刊发表SCI论文20余篇，承担国家自然科学基金、国家重点研发计划子任务国家级科研项目3项，省市级项目4项，先后获得大连市青年科技之星、辽宁省百千万人才万人层次等荣誉称号，以第六完成人获得大连市技术发明一等奖1项，辽宁省技术发明二等奖1项。
谭明乾，大连工业大学教授，博士生导师，食品交叉科学研究院院长。国家杰出青年科学基金获得者，入选辽宁省“百千万人才工程”百人层次人才，辽宁省科技创新领军人才。获辽宁省自然科学二等奖。享受国务院政府特殊津贴。发表SCI收录论文200余篇，论文被引用8000余次。编写英文科技著作2部，参编图书章节5部。以第一发明人获得授权发明专利15件。Wiley学术期刊Food Safety and Health主编，Trends in Food Science & Technology, Food Science Human Wellness编委以及《食品科学》编委。主要从事的领域：（1）食品加工营养素结构转化与相互作用机制；（2）食品功能因子稳态化靶向递送及精确营养。
Curcumin delivery nanoparticles based on Maillard reaction of Haematococcus pluvialis protein/galactose for alleviating acute alcoholic liver damage
Xinyi Liua,b, Yukun Songa,b, Shasha Chenga,b,*, Mingqian Tana,b,*
a School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China
b National Engineering Research Center of Seafood, Dalian 116034, China
*Corresponding author.
Abstract
The aim of this study is to investigate the feasibility of Maillard reaction products of Haematococcus pluvialis protein and galactose (HPP-GAL) for improving the bioactivities of curcumin (CUR) for alleviating alcoholic liver damage. CUR was embedded into HPP-GAL nanoparticles by the self-assembly of hydrogen bonding and hydrophobic interaction with the particle size around 200 nm. HPP-GAL enhanced the encapsulation efficiency and loading amount of CUR with the value of (89.21 ± 0.33)% and (0.500 ± 0.004)%, respectively. The stabilities of CUR under strong acid, salt ion stability and ultraviolet irradiation conditions were improved by the encapsulation. HPP-GAL-CUR nanoparticles exhibited excellent concentration-dependent in vitro antioxidant activities including DPPH and ABTS scavenging rates, and better protective effect on CUR against gastric acid environment as well as longer release of CUR in simulated intestinal fluid. In addition, the HPPGAL-CUR delivery system possessed liver targeting property due to the existence of GAL, which could effectively alleviate the alcohol-induced liver damage and the inflammation indexes by inhibiting the oxidative stress. Therefore, HPP-GAL-CUR nanoparticles might be a potential candidate system for the prevention of alcoholic liver damage in the future.
Reference:
LIU X Y, SONG Y K, CHENG S S, et al. Curcumin delivery nanoparticles based on Maillard reaction of Haematococcus pluvialis protein/galactose for alleviating acute alcoholic liver damage[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 2629-2641. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250211.
本文编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片来源：图虫创意
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