1866年的普鲁士跟奥地利之间爆发了战争，即普奥战争，又称七周战争，是近代战争史上发生于中欧地区的一场战争，是普鲁士为争夺统一德意志领导权而对奥地利进行的一场战争。普鲁士的目的不是想屈辱奧国，也更想削弱它，而是要使奥国认清，在日尔曼，民族主义已经是大势所趋，它要求统一，不准奥国加以反对。对奥战争的爆发是普鲁士领导德国统一的关键一步，俾斯麦对此花费了巨大精力。自1864年10月对丹麦的和约签字开始，俾斯麦便领导普鲁士政府积极投入战争准备工作，决定以军事力量解决普鲁士在德意志的霸权问题。
普奥战争的爆发对于双方而言都不意外，而且阵线早已分明。19世纪初，德意志分崩离析，四分五裂，随着时代的发展需要，面临着统一的问题。在统一德意志领导权的问题上，普鲁士跟奥地利相争由来已久，尽管普鲁士在德意志各邦国中实力最强，不过跟疆域广大的奥地利比起来，还是稍逊一筹。长期以来，中欧大国奥地利一直都占据着领导地位。1848年3月，德意志联邦的各邦代表于美因河畔的法兰克福进行了预备会议，会上选出了奥地利的约翰大公担任临时的德意志帝国首脑。不过该首脑的设立形同虚设，掌握不了实权，各邦王公也不听调遣。
1862年，俾斯麦被普鲁士国王威廉一世任命为首相。主张以“铁”与“血”实现德意志统一的俾斯麦上任后，很快便策划统一且由普鲁士主宰德意志的活动。跟丹麦之间的战争胜利后，俾斯麦接着策划对奥地利的战争，在他看来，只有通过战争才能实现统一德意志的宏图大业。在发动跟奥地利的战争前，俾斯麦做了很多外交方面的努力，先是跟和奥地利有冲突的意大利结成反奥联盟，让其于战争开始后从奥地利的背后出击，令奥地利陷入两面作战的情况。而后还稳定了那时候的欧洲霸主法国，令法国答应不加干涉。
毕竟在法国看来，那时是奥地利帝国于欧洲是一支强大的军事力量，俾斯麦的做法无疑是在自掘坟墓。因此，法国不但没有做好干涉的准备，反而还担心万一普鲁士输得太惨，会不会令法国丧失对奥地利的战略优势。俾斯麦就是利用了法国的这个心理误算，加上又跟俄国交好，成功避免了普鲁士的多线作战。
一切准备就绪后，俾斯麦向奥地利提出了貌似公允却难以被对方接受的条件：两个从丹麦夺来的公国由普鲁士亲王管理，但不并入普鲁士。奥地利对普鲁士吞并这两个公国的背后企图心知肚明，为打击普鲁士的野心，奥地利于1866年6月1日提出将两公国的前途交由德意志联盟议会表决，以便使普鲁士跟整个联盟为敌。见此，俾斯麦当即宣称奥地利将两公国前途交由德意志联盟裁决的决定破坏了奥普两国共管两公国的加斯坦因协定，便命普军在6月7日开进了由奥地利管辖的公国——荷尔斯泰因。
6月14日，奥地利组织召开的德意志联邦议会以9:6的票数通过了反对普鲁士的方案后，俾斯麦立即声明联邦议会无权用这种方式对待成员，且坚决要求解散联邦议会。同时向萨克森国王、汉诺威国王等三个德意志邦国提出最后通牒，要求他们接受普鲁士提出的《联邦改革纲要》，且允许普军自由通过他们的国土。普鲁士的过分要求自然遭到了三个邦国的拒绝。
当日，俾斯麦请一位法国记者和他共进晚餐，席间他将对三国下最后通牒事透露给记者，那位记者当即将消息发往巴黎，这等于是公开向奥地利发起挑战。奥地利在德意志联邦中也是有盟友的，在德意志境内，中南部的邦几乎一边倒地追随奥地利，在北部也不乏追随者，不过奥地利的指挥体系效率太低，各邦之间的协调也存在问题。而另一边是普鲁士则在开战之初便利用其战略性的铁路系统快速抢占要点，迅速控制了汉诺威跟库尔黑森诸邦，并占领了德意志联邦议会所在地法兰克福。
14日，普奥战争揭开了序幕，20日，意大利根据意普盟约对奥宣战，普鲁士利用跟意大利的结盟，将部分奥军吸引到南部战场。普鲁士方面战争的指挥者总参谋长毛奇将军，根据自己制定的作战计划，利用先进的铁路运输实施战略输送，使用先进的电报手段进行统一指挥，在很短的时间内，便把25万余兵力跟800门火炮集结到了萨克森和奥地利的边境地区。
俾斯麦没料到的是，意大利的军队居然不堪一击，开战没多久便因失败而失去了对奥军的威胁，自然令奥军两线作战的设想落了空，普军在战场上的优势不再存在，战局变得难以确定。不过，在南部意军失利的同时，北部的普鲁士军队在短时间内还是控制了整个北德意志。
7月3日，卡尔亲王的第一军团自西向东对奥军发起了正面攻击，因为有利的地形跟炮兵的有效支援，奥军很快挡住了普军的进攻，且展开了反击，第一军团随之陷入危急之中。对此，卡尔亲王要求派预备队支援第一军团战斗，建议第二军团立即投入交战。不过毛奇对于自己的部署信心十足，拒绝改变原定计划。事实上，毛奇的决策是正确的，他之所以用第一军团去做正面攻击，就是要以此吸引和牵制奥军主力，而以易北河军团和第二军团攻击敌军的两侧和后方，对奥军实行南北夹击。
从侧翼杀来的普军劲旅使毫无防备的奧军整个阵线顿时陷于崩溃之中，奥军各部溃不成军，三个小时后，萨多瓦战役以普鲁士全胜结束。此役决定了战争的命运，奥地利军队已无力再战胜利之际，普军上下兴奋不已，军事将领纷纷主张长驱直入占领维也纳，迫使对手缔结城下之盟。俾斯麦毫不客气地指出，那样只能让法国渔翁得利，只怕普军未入维也纳，法军便已过菜茵河。
而且俾斯麦还有更深远的用意，打败奥地利只是开头，普鲁士真正的敌手是法国，俾斯麦绝对不想将奥国变成一个死敌，因为他知道有一天为了欧洲的霸权，德法之间势必要做一次决斗，他希望奥国到时候能保持中立。因此，俾斯麦不仅不进军维也纳，反而主张跟奥地利签订体面的和约。在随后的普法战争中，奥地利果然没有乘机对普鲁士下手，从而使普鲁士避免了两线作战之忧。
7月26日，德奥缔结停战协定，8月23日，奧普签订了《布拉格和约》，普鲁士获得了石勒苏益格-荷尔斯泰因及汉诺威等地，而奥地利退出了德意志联邦，昔日奥地利在欧洲的政治地位就此一去不复返。普鲁士因获得汉诺威、石勒苏益格、黑森和纳绍而大大扩张了版图，跟德意志南部各公国也分别订立了有利的军事盟约，次年以普鲁士为首建立了北德意志联邦，基本完成了德意志的统一。正坐山观虎斗的法国完全没有料到普奥之间的战争会是这样的结局，完全没有给他们插手的机会战争就结束了，法国才恍然一个新的强劲对手已然出现。
普奥战争后，由普鲁士控制的北德意志联邦成立了，不过南部的巴伐利亚、符腾堡、巴登、黑斯-达姆斯塔四邦还是置身于联邦之外。俾斯麦没有因为其于普奥战争中站在奥地利一边而做什么，也没有强迫他们加入北德联邦。他只是将普奥战争后法国对莱茵河诸邦的吞并野心通知给巴伐利亚国王及南德意志诸邦政府，从而在南德诸邦中造成了恐惧法国的心理，以此获得他们的支持，促使南德诸邦与其缔结同盟，为下一步的普法战争做好准备。至此，德国统一只剩最后一个、也是最大的障碍，那便是拿破仑三世跟他的法兰西帝国。
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