DNA-蛋白质交联（DNA-protein crosslinks, orDPCs） 是一种由蛋白质共价结合到DNA分子上而引发的DNA损伤。与染色质相互作用的蛋白在暴露于内源性DNA损伤 （如无碱基位点等） 或外源性 （紫外照射和化疗等） 因子后容易与DNA形成这类共价交联【1】。根据其化学性质，DPCs可分为两类。第一类是酶特异性DNA-蛋白质共价结合体，这些是多种核酶 （例如拓扑异构酶（topoisomerases）、酪氨酸DNA磷酸二酯酶I (tyrosyl-DNA phosphodiesterase I, or TDP1), DNA和RNA聚合酶以及HMCES等） 的正常酶催化中间体。但在酶功能失调、内源性DNA损伤暴露或其特异性抑制剂处理下可能被捕获形成牢固且不可逆的交联【2】。第二类是非酶促DPCs，这些由内源性反应性代谢物或外源性因子引发的蛋白质与DNA附近的交联所致。由于暴露于活性氧物种、脂质过氧化产物以及正常细胞代谢过程中，若缺乏有效的DNA修复机制，非酶促DPCs会在大脑及其他组织中逐渐累积。这其中环境以及人体自身产生的包括甲醛和乙醛在内活性醛类 （aldehydes） 是非酶促DPCs的重要诱导剂之一【3】。由于其庞大的体积和对DNA双螺旋结构的干扰，DPCs会妨碍复制和转录机器的进程，从而阻碍基因信息的准确表达。DPC引起的DNA损伤会导致癌症、神经退行性疾病、免疫缺陷、肝毒性及早衰。研究表明，DPC可以通过泛素化蛋白酶体或DNA依赖金属蛋白酶SPRTN水解修复或者通过p97/VCP ATPase去活性来加速蛋白酶介导的水解修复。然而对于甲醛诱导的DPCs，由甲醛在DNA碱基的氨基和蛋白质赖氨酸ε-氨基 （次级胺） 之间形成的亚甲基键并非蛋白酶的底物，蛋白酶无法酶切完整的DPC因而只能完成部分修复。因此，DPCs, 尤其是非酶促DPCs的完全修复极有可能是蛋白酶与核酸酶共同完的。但是具体是哪种核酸酶参与了DPC的修复目前还属未知。
近日，来自美国马里兰大学医学院，药学院和综合癌症中心的孙逸伦研究团队与美国国立卫生研究院国家癌症研究所的Yves Pommier研究团队在Science Advances发表题为Flap endonuclease 1 repairs DNA-protein cross-links via ADP-ribosylation-dependent mechanisms的研究论文。该研究发现了Flap endonuclease 1 （FEN1）以及剪辑切除修复通路 （base excision repair, BER）在DNA-蛋白质交联修复中发挥重要作用。作者发现甲醛诱导的非酶促DPCs和化疗药物依托泊苷etoposide和阿霉素doxorubicin诱导的Topoisomerase II (TOP2)-DPCs会形成 5’-flap结构而成为FEN1的底物，前者是BER通路的中间产物而后者则是由于TOP2酶活性而天然形成。作者同时发现PARP1介导的二磷酸腺苷核糖基化 (ADP-ribosylation) 在这一修复通路当中起到了重要的调控作用。
研究人员首先通过开发一种蛋白质组学方法确定了哪些蛋白质会被甲醛交联到DNA上。研究人员在不同的癌细胞里通过in vivo complex of enzyme (ICE) bioassay提取了 DNA, 随后将DNA用micrococcal nuclease进行酶切从而释放与DNA交联的蛋白来做质谱分析。结果显示，多种topoisomerases, PARP, DNA methyltransferases, DNA和RNA polymerases, High mobility group (HMG) proteins, HMCES以及组蛋白等极易在暴露在甲醛的环境里与DNA形成共价交联。
随后，研究人员通过RNAi高通量筛选的方法发现FEN1下调会显著提高甲醛的细胞毒性。再通过改良一种叫做RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) 的细胞生化方法，研究人员发现FEN1下调阻碍甲醛介导的DPC修复从而积累细胞内的DPCs而上调FEN1会显著减少DPC的积累。由于FEN1是一种与复制相关的核酸酶，也参与冈崎片段成熟及BER过程【4】，作者推测FEN1通过切割由BER途径产生的DNA单链片段或冈崎片段中的RNA-DNA混合片段中的DPC来实现去除。进一步研究结果显示，FEN1上调导致的DPC加速修复依赖于蛋白酶体和p97/VCP【5】，说明FEN1只能作用于部分蛋白水解或变性的DPCs。这种依赖很可能是由于体积庞大的蛋白大分子在空间上阻碍FEN1与5’ flap交界处的交互造成的。
由于FEN1的作用底物为5‘末端的DNA flap结构，作者猜测甲醛不仅会诱导DNA蛋白质共价交联同时也会在DPC附近造成碱基损伤，从而通过唤醒BER来修复碱基损伤。这一过程中，损伤的碱基会形成5’ flap结构成为FEN1的底物。而由于DPC就在损伤碱基附近，5’ DNA flap就正好包含了交联的蛋白质组分从而被FEN1修复。为了验证这一假设，研究人员通过proximity ligation assay (PLA) 确定了甲醛诱导的DPC和甲醛产生的损伤碱基8-oxo-dG空间距离极近。同时研究人员通过建立体外生化方法，确定了纯化FEN1蛋白，对于包含交联氨基酸的5’ flap底物有酶切活性而对于包含交联蛋白大分子的5’flap底物的酶切活性较低。这一发现与之前体内实验得出的FEN1只能作用于部分蛋白水解或变性的DPCs的结论一致。
研究人员随后通过包括DNA combing assay, comet assay, 和流式细胞术等方法发现FEN1低表达和完全敲除细胞内由甲醛产生的DNA损伤和DNA复制抑制与野生型细胞比程度更高，进一步说明FEN1在甲醛诱导DNA损伤和基因不稳定性的重要修复作用。
另外，研究人员还发现FEN1作用于化疗药物依托泊苷etoposide和阿霉素doxorubicin诱导的酶促Topoisomerase II (TOP2) -DPC上。由于这类DPC由于TOP2的酶切活性会天然形成包含DPC的5’ flap结构，FEN1对于这类DPC的修复不需要BER的介入。但是实验表明，FEN1仍需要上游的蛋白酶体对TOP2-DPC水解或者p7/VCP对TOP2-DPC去活从而完成酶切。
为了研究FEN1在DPC修复中的调控机制，研究人员通过改良RADAR assay发现甲醛诱导的非酶促DPC以及etoposide诱导的TOP2-DPCs会被polyADP-ribose大量修饰。而其他如顺铂在内 的DPC诱导剂诱导产生的DPC则不会被polyADP-ribose修饰。研究人员还发现只有在经过PARG (polyADP-ribose glycohydrolase， 一种核糖核苷酶) 抑制剂预处理的细胞内才会检测到DPC polyADP-ribosylation （PARylation） ，而PARG抑制剂预处理过的细胞内DPC本身的水平也显著提高了。这些现象表明 DPC PARylation是一个瞬时且可逆的过程，不能及时移除DPC的PAR修饰 (dePARylation) 会阻碍DPC的修复清理。因为PARP1是PAR的聚合酶以及DNA损伤应答蛋白【6】，研究人员从而猜测PARP1对DPC的ADP-ribose修饰可能在FEN1在DPC的过程中起到重要的调控作用。研究人员通过蛋白组学发现，许多的染色质交互蛋白都会在甲醛处理过的细胞中被PAR修饰。这其中包括拓扑异构酶，DNA和RNA聚合酶，以及DNA methyltransferases等。研究人员还发现FEN1同样被PAR修饰。由于研究人员已发现FEN1并不会被甲醛诱导与DNA交联，研究人员猜测PARP1介导的PARylation可能同时修饰DPC底物和FEN1来调控这一修复机制。通过PLA，研究人员发现抑制PARP1会阻碍FEN1的招募使其无法与DPC交互。体外生化实验结果显示，ADP-ribose修饰并不影响FEN1的酶活性。所以研究人员得出结论，DPC的ADP-ribose修饰主要是作为信号唤醒招募FEN1, 而FEN1的ADP-ribose修饰可能起到运送FEN1到损伤位点与DPC交互。
最后，通过Enzymatic Labeling of Terminal ADP-Ribose （ELTA） 标记方法和蛋白组学，研究人员发现了FEN1的ADP-ribose主要修饰位点为285位的谷氨酸残基。通过谷氨酸-谷氨酰胺 （E285Q） 点突变，研究人员发现该突变体在细胞内无法与甲醛诱导的非酶促DPC和etoposide诱导的TOP2-DPC交互也无法修复这两类DPC。
最终，作者得出FEN1修复非酶促和酶促TOP2-DPC的两种作用模型：1. 在链置换过程中，冈崎片段的5'-单链片段中的DPCs被PARP1感知，从而引PARylation，激活FEN1进行修复，而DPCs在PARG介导的dePARylation后完成修复。与非末端DPCs相邻的受损碱基 （在复制叉前方和复制叉后方的领先链上） 通过单链中断由碱基切除修复 （BER） 蛋白转化为包含DPC的5'-单链片段，这些结构可以被PARP1检测到并引发PARylation以信号招募FEN1。富集于冈崎片段附近的FEN1通过PARP1的PARylation被重新定位至复制叉前方和领先链后方的DPC位置。在dePARylation后，FEN1对包含DPC的5'-单链片段进行切割。2. TOP2是一种同二聚体酶，可在复制叉前方作用以松弛积累的正超螺旋。这种同二聚体切割DNA的两条链，并将另一条DNA分子通过断裂的位置传递过去。在这种配置中，每个断裂的5′端通过共价键连接到蛋白质两个亚基活性中心的酪氨酸上。在此情况下，由于TOP2两个亚基之间强大的蛋白质-蛋白质相互作用，断裂的DNA两侧可以在原位被重新连接。这种瞬时的酶-DNA中间体可以被其抑制剂 （如etoposide） 捕获。抑制剂与DNA和其中一个亚基之间界面的结合导致单链5'-TOP2-DPC的形成，该结构可以通过翻译后修饰、构象变化或聚合酶活性转化为5'-单链片段结构。PARP1感知与TOP2相关的单链断裂 （SSB） 并对DPC进行PARrylation以信号招募FEN1。位于复制叉后方冈崎片段的FEN1也被PARP1 修饰，从而驱动FEN1前往DPC位置，并在dePARylation后完成切割修复。
总之，该文章揭示了FEN1和PARP1在修复复制中产生的DPC重要作用，为甲醛及其诱导DPC相关的病原学研究提供了分子生物学基础。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ads2919
制版人：十一
参考文献
1. Weickert, P. & Stingele, J. (2022). DNA-protein crosslinks and their resolution.Annu. Rev. Biochem.91, 157–181.
2. Pommier, Y., Sun, Y., et al. (2016). Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability.Nat Rev Mol Cell Biol,(11):703-721.
3. Swenberg, J.A., Moeller, B.C., Lu, K., Rager, J.E., Fry, R.C., and Starr, T.B. (2013). Formaldehyde carcinogenicity research: 30 years and counting for mode of action, epidemiology, and cancer risk assessment.Toxicol. Pathol.41, 181–189.
4. Balakrishnan, L. & Bambara, R. A. (2021). Flap endonuclease 1. (2013).Annu Rev Biochem.82:119-38.
5.Sun, Y., et al. (2022). Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells.Front Mol Biosci. Sep 23:9:1007064.
6. Suskiewicz, M. J., et al. (2023). ADP-ribosylation from molecular mechanisms to therapeutic implications.Mol. Cell. Oct 12;186(21):4475-4495.
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