红肉是指哺乳动物肌肉来源的肉，含有丰富的蛋白质，富含铁和磷等无机盐以及B族维生素为首的多种维生素，但大量红肉和加工红肉摄入会显著增加结直肠癌的发病率，也会导致患食道癌、子宫内膜癌、胃癌的风险显著升高。 研究表明，肠道菌群会对机体神经、消化、呼吸、心血管及肿瘤等多种疾病产生影响，尤其与肠道炎症和结直肠癌的发生密切相关。
湖南农业大学食品科学技术学院的贺乐丽、刘楚鑫、吴艳阳*等人 以CMP-Neu5Ac羟化酶敲除（Cmah -/- ）小鼠作为模拟人体的模型动物，通过喂 食富含结合态N-羟乙酰神经氨 酸（Neu5Gc）的猪颌下腺黏蛋白（PSM）探讨Neu5Gc对Cmah -/- 小鼠血清炎症因子和肠道菌群的影响。
01
Neu5Gc对小鼠摄食量和体质量变化的影响
根据《中国居民膳食指南（2022）》最大肉类进食量中Neu5Gc的含量以及Banda和Samraj等研究中采用的Neu5Gc喂食量，本研究将从PSM中提取的含量为0.25 mg/g的Neu5Gc添加到饲料中，喂食Cmah-/-小鼠18 周，以模拟人在摄入红肉后Neu5Gc在人体内无法分解并沉积在肝脏、肾脏和肠道等器官中产生异种唾液酸炎过程。在此期间对小鼠进行饲料摄入量和体质量变化的监测，由图1A可知，雄鼠组的平均饲料摄入量普遍高于雌鼠组，其中PSM组雄鼠的平均饲料摄入量最高，为25.63 g/周，普通组雌鼠最低，为21.60 g/周。喂食18 周后，与第2周相比，各组小鼠的体质量增加百分比都显著升高（P＜0.05），其中雄鼠组小鼠体质量增加百分比显著高于雌鼠组（P＜0.05）（图1B）。
02
Neu5Gc对小鼠炎性细胞因子表达水平的影响
通过ELISA检测促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β和SAA水平探究Neu5Gc对小鼠血清炎性细胞因子质量浓度的影响。如图2A～D所示，与普通组雄鼠相比，PSM组雄鼠中促炎细胞因子IL-6、TNF-α和SAA的质量浓度显著升高（P＜0.05），IL-1β质量浓度无显著改变。与普通组雌鼠相比，PSM组雌鼠中促炎细胞因子IL-6、TNF-α和SAA的质量浓度显著升高（P＜0.05），IL-1β质量浓度无显著改变。表明PSM中的Neu5Gc显著增加了小鼠炎性细胞因子IL-6、TNF-α和肝脏组织合成的急性反应蛋白SAA的表达。在外界刺激下细胞中的NF-κB信号通路会被激活，使得IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子表达水平上升。为了确定Neu5Gc是否激活NF-κB信号通路，采用蛋白质印迹法评估小鼠肝脏中NF-κB信号通路中关键蛋白NF-κB亚基（p65）和核因子κB抑制蛋白α（IκB-α）的磷酸化水平。如图2E所示，与普通组雄鼠和雌鼠相比，PSM组雄鼠和雌鼠中p-p65和p-IκB-α的蛋白表达水平明显增加。上述结果表明，PSM组中的Neu5Gc使得p65和IκB-α蛋白发生磷酸化，激活了NF-κB信号通路，促进了IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子的表达水平，从而引发Cmah -/- 小鼠体内炎症反应的发生。
03
Neu5Gc对小鼠肠道菌群结构的影响
3.1 Venn图分析
Venn图用于显示各组样品中共有和特有的OTU数，可以直观反映各组样本物种组成相似性和重叠情况。由图3可知，普通组雄鼠总序列数有648个，普通组雌鼠有676个，PSM雄鼠有689个，PSM雌鼠有629个；其中，4组小鼠共有473个OTU序列数，普通组雄鼠、普通组雌鼠、PSM组雄鼠、PSM组雌鼠特有的OTU数分别为34、66、62、28个。由此可得，各组小鼠肠道菌群的群落多样性差异性较大，PSM中的Neu5Gc改变了小鼠肠道微生物的群落组成。
3.2 Alpha多样性分析
单样本的多样性（Alpha多样性）分析可以反映微生物群落的丰富度和多样性。在表1的Alpha多样性分析中，Sobs指数代表肠道菌群的群落丰富度，PSM组雌鼠的Sobs指数显著低于普通组雌鼠（P＜0.05），表明PSM中的Neu5Gc降低了雌鼠组肠道菌群的群落丰富度。PSM组雌鼠的Coverage指数也显著低于普通组雌鼠（P＜0.05），表明PSM组雌鼠序列没有被测出的概率高于普通组雌鼠。Simpson和Shannon指数可用来估算样品中微生物的多样性，Shannon指数越小，Simpson指数越大，表明群落多样性越低，PSM组小鼠的Shannon指数均小于普通组雄鼠和雌鼠，Simpson指数均大于普通组小鼠，但不显著，表明PSM中的Neu5Gc没有使小鼠肠道菌群的多样性发生显著变化。
3.3 Beta多样性分析
Beta多样性可以评估不同组间微生物群落间的差异，本研究通过主成分分析（PCA）、非度量多维尺度分析（NMDS）、组间差异分析和相似性分析揭示。图4A中，普通组雄鼠位于左上象限，普通组雌鼠主要位于右下象限，PSM组雄鼠和雌鼠位于左下象限。图4B中，4 组小鼠均位于不同的象限。由此可得4 组小鼠的微生物群落结构明显分离，表明PSM中的Neu5Gc显著改变了Cmah -/- 小鼠肠道中微生物的生物群落结构。组间相似性分析可以用来检验组间差异是否显著大于组内差异，从而判断分组是否有意义。相似性分析在Bata多样性中常被看作一个量化的数值，可反映每个组内各个样本间的群落物种组成差异。因此本研究通过相似性分析检验4 组小鼠分组是否有意义。如图4C所示，R＝0.821＞0，各组小鼠肠道菌群的组间差距大于组内差异，P＝0.001＜0.05，各组小鼠肠道菌群群落结构差异显著，由图4D的P＝0.04763＜0.05也可得出相同的结论。
3.4 群落组成分析
通过在不同分类学水平上统计各样本的物种丰度，可以直观反映各组小鼠肠道菌群的群落组成差异。本研究从门、科、属3 个水平探讨了PSM中的Neu5Gc对Cmah -/- 小鼠肠道菌群种类及丰度的影响。小鼠肠道菌群在门水平的丰度如图5所示，各组菌群总量排名前2的是拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes），二者相对丰度占比在各组中均超过了90%。其中PSM组雄鼠的厚壁菌门相对丰度显著高于普通组雄鼠，拟杆菌门菌群的相对丰度显著降低（P＜0.05），雌鼠组无显著差异（图5A～C）。当厚壁菌门和拟杆菌门丰度比值（F/B）升高时，会引起小鼠肠道菌群失调，由图5D可知，PSM组雄鼠的F/B值显著高于普通组雄鼠（P＜0.05），雌鼠组无显著差异。这表明PSM中的Neu5Gc会影响Cmah-/-雄鼠厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度，使得F/B升高，导致小鼠肠道菌群失调。
各组小鼠肠道菌群多样性在科水平如图6 A 所示，普通组相对丰度较高的分别是Muribaculaceae、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、颤螺旋菌科（Oscillospiraceae）。而PSM组中Muribaculaceae、毛螺菌科、乳杆菌科（Lactobacillaceae）和norank_o_Clostridia_UCG-014的相对丰度较高。其中PSM组雄鼠的Muribaculaceae和Prevotellaceae的相对丰度显著低于普通组雄鼠（P＜0.05），而norank_o_Clostridia_UCG-014的相对丰度显著高于普通组雄鼠（P＜0.05）。雌鼠组无显著差异。相较于普通组雌鼠，PSM组雌鼠颤螺旋菌科（Oscillospiraceae）的相对丰度显著低于普通组雌鼠（P＜0.05）。
各组小鼠肠道菌群多样性属水平如图7 A 所示，普通组菌群相对丰度排名前2 的是norank_o_Muribaculaceae和Lachnospiraceae_NK4A136_group。PSM组菌群相对丰度排名前2的则是norank_o_Muribaculaceae和norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014。其中P SM 组雌鼠的unclassified_f_Lachnospiraceae 相对丰度显著低于普通组雌鼠（P＜0.05），雄鼠组无显著差异（图7B）。PSM组雄鼠的norank_o_Muribaculaceae的相对丰度显著低于普通组雄鼠（P＜0.05），雌鼠组无显著差异（图7C）。由图7D所知，与普通组相比，PSM组雄鼠和PSM组雌鼠norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014的相对丰度均显著升高（P＜0.05）。除此之外，PSM组雄鼠的Prevotellaceae_NK3B31_group的相对丰度显著高于普通组雄鼠（P＜0.05），雌鼠组无显著差异（图7E）。
3.5 组间差异物种判别分析
LEfSe可以实现两个或者多个分组之间的比较，从而找到组间在丰度上有显著差异的物种。并通过线性判别分析（LDA）估算每个物种丰度对差异效果影响的大小，本研究设定的LDA为2.0。由图8可知，对各组物种丰度差异效果影响由大到小排序，其中与普通组雄鼠相比，PSM组雄鼠显著差异物种排序分别为克里斯滕森菌目（Christensenellales）、克里斯滕森菌科（Christensenellaceae）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）；与普通组雄鼠相比，PSM组雌鼠显著差异物种为α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、颤螺菌目（Oscillospirales）、微球菌目（Micrococcales）。
04
小鼠肠道菌群与炎症细胞因子的相关性分析
为了进一步研究特定肠道菌群相对丰度与小鼠血清中炎症细胞因子之间的相关性，本研究分别对雄鼠组和雌鼠组的属水平中相对丰度较高的菌群与小鼠血清中炎症细胞因子质量浓度进行了Spearman相关性分析，并将获得的数值矩阵通过热图直观展示。由图9A可知，在普通组雄鼠和PSM组雄鼠中，与炎症细胞因子IL-6呈显著负相关的菌群是Rikenellaceae_RC9_gut_group和Colidextribacter；与TNF-α呈显著正相关的菌群是Anaerostipes和Brachyspira，呈显著负相关的菌群是norank_f_Muribaculaceae、Prevotellaceae_NK3B31_group和Parabacteroides；与IL-1β呈显著正相关的菌群是Lactobacillus和Anaerostipes，呈显著负相关的菌群是norank_f_Muribaculaceae、Alloprevotella、Alistipes、norank_f_Oscillospiraceae、Parabacteroides和Colidextribacter；与SAA呈显著正相关的菌群是Anaerostipes、Helicobacter和Brachyspira，呈显著负相关的菌群是norank_f_Muribaculaceae、Alloprevotella、norank_f_Oscillospiraceae、Prevotellaceae_UCG-001。而图9B的普通组雌鼠和PSM组雌鼠中，与炎症细胞因子IL-6呈显著负相关的菌群是Muribaculum和Helicobacter，无显著正相关菌群；与TNF-α呈显著负相关的菌群是Eubacterium_xylanophilum_group，无显著正相关菌群；与IL-1β显著负相关的菌群是Lachnospiraceae_NK4A136_group、Eubacterium_xylanophilum_group和Muribaculum，无显著正相关菌群；与SAA呈显著正相关的菌群是Bacteroides和Parabacteroides，呈显著负相关的菌群是Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae、Eubacterium_xylanophilum_group、Colidextribacter。
05
大量膳食红肉及其加工制品中的Neu5Gc在人体内不断积累，从而引发慢性炎症反应，最终导致了人患癌症风险增加。本研究采用Cmah-/-小鼠作为模拟人体的模型动物，以普通饲料和PSM饲料（Neu5Gc含量为0.25 mg/g）喂食小鼠18 周后，检测各组小鼠血清炎症因子质量浓度和肠道菌群的变化，发现Neu5Gc改变了肠道菌群的丰富度和物种组成，激活了NF-κB信号通路，显著增加了小鼠炎性细胞因子的表达，引发了小鼠炎症反应。
已知肠道菌群可以通过激活先天性免疫诱导适应性免疫反应，调节免疫细胞和多种信号通路来发挥免疫调节作用，并通过促进抗炎因子的分泌，降低炎性因子的分泌使肠道免疫处于稳定状态。本研究在给小鼠注射抗Neu5Gc抗体后得出PSM中Neu5Gc显著增加了Cmah-/-小鼠中促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和SAA的质量浓度，这与Samraj等的结果一致。蛋白印迹分析表明PSM中Neu5Gc促进了IκB-α和p65的磷酸化，从而激活了NF-κB信号通路，表明PSM中的Neu5Gc通过激活NF-κB信号通路显著增加小鼠炎性细胞因子IL-6、TNF-α和肝脏组织合成的急性反应蛋白SAA的表达。
本研究通过16S rDNA高通量测序分别对4 组Cmah-/-小鼠肠道内容物进行分析，并从样本多样性和样本间群落组成差异性两个方面比较各组小鼠肠道菌群的差异。Bacteroidetes和Firmicutes是人类和许多其他脊椎动物肠道菌群的两大类主要菌，二者的数量存在反比关系。研究表明动物和人类的Firmicutes的丰度与小鼠的肥胖水平呈正比，肥胖倾向的大鼠表现出肠道炎症和微生物群变化，且较高F/B值与人类肥胖、IBD和2型糖尿病等疾病相关。Mei Xue等的研究表明了与非IBD患者相比，IBD的患者F/B值显著升高。在本研究中，与普通组雄鼠相比，PSM组雄鼠F/B值显著升高，由此表明PSM中的Neu5Gc可能引发了Cmah-/-雄鼠肠道炎症的发生。
已知肠道菌群产生的乙酸、丙酸和丁酸等SCFAs可通过抑制NF-κB通路来抑制炎症细胞因子的释放，从而减轻机体产生的炎症反应。Muribaculaceae可以产生乙酸和丙酸，Lachnospiraceae具有降解毒素和产生丙酸的能力，二者均是健康机体常见的肠道微生物。Prevotellaceae丰度的减少可导致SCFAs丁酸盐减少以及促炎细胞因子的释放和诱导型Treg的减少，诱导血浆脂多糖水平升高，从而导致全身炎症。已知Prevotellaceae_NK3B31_group与皮质醇水平呈正相关，已有研究报道皮质醇水平与较高的促炎细胞因子相关。除此之外，有研究表明促炎菌群Clostridia UCG-014相对丰度增加可使机体发生炎症，上调脂质促炎代谢产物，最终加剧急性心肌梗死。如约氏乳杆菌可通过上调Muribaculaceae等菌群，下调Clostridia UCG-014等菌群减少梗死面积、缺血损伤和炎症反应，缓解急性心肌梗死的发展。本研究的科水平和属水平中，与普通组相比，PSM组雄鼠的Muribaculaceae和Prevotellaceae的相对丰度显著降低（图6B、D和7C），PSM组雌鼠的unclassified_f_Lachnospiraceae的相对丰度显著降低（图7B），PSM组雄鼠Prevotellaceae_NK3B31_group的相对丰度显著升高（图7E）。科水平中，PSM组雄鼠的Clostridia UCG-014的相对丰度显著升高（图6C），属水平中，PSM组雄鼠和PSM组雌鼠中Clostridia UCG-014的相对丰度均显著升高（图7D）。由此表明，PSM中的Neu5Gc可能是通过降低Muribaculaceae、Lachnospiraceae和Prevotellaceae的相对丰度，减少乙酸和丙酸等SCFAs的产生，增加促炎菌群Prevotellaceae_NK3B31_group和Clostridia UCG-014的相对丰度，从而使得Cmah -/- 小鼠中炎症细胞因子的释放，引发机体的炎症反应。
受到肠道菌群的影响，免疫特别是自身免疫具有性别差异性。与此同时，由于性激素的驱动，肠道菌群也具有性别差异性。而性激素反过来又导致了免疫力的性别差异性以及对多种感染和慢性疾病的易感性，因此肠道菌群的性别差异性是肠道菌群、性激素和免疫系统的双向相互作用。在动物肠道菌群受性别影响研究中，Zhang Xiuying等证明了不同种族来源的成年人存在常见的性别依赖性的肠道菌群特征，表明肠道菌群存在性别依赖性；Org等对具有特定遗传背景的小鼠进行检测，表明性别差异对肠道菌群的组成有明显的影响，但肠道菌群受性别影响的机理目前还没有确切结论。在本研究中，PSM组雌鼠Alpha多样性分析中的Sobs指数显著低于普通组雌鼠，而雄鼠组没有显著差异，表明性别差异对小鼠肠道菌群的群落丰富度的有影响。在对肠道菌群群落组成分析中，与普通组雄鼠相比，PSM组雄鼠的厚壁菌门相对丰度显著升高，拟杆菌门菌群的相对丰度显著降低，F/B值显著升高，而雌鼠组无显著差异；在科水平中，PSM中的Neu5Gc显著降低了雄鼠组的Muribaculaceae和Prevotellaceae的相对丰度，显著升高了norank_o_Clostridia_UCG-014的相对丰度，对雌鼠组无显著影响；在属水平中，PSM中的Neu5Gc显著降低了雄鼠组的Muribaculaceae的相对丰度，显著升高了Prevotellaceae_NK3B31_group的相对丰度，对雌鼠组无显著影响；而在雌鼠中，科水平中的Oscillospiraceae和属水平中的unclassified_f_Lachnospiraceae的相对丰度显著降低，雄鼠组无显著变化。在差异物种判别分析中，雄鼠组显著差异物种为Christensenellales和Ruminococcus等，雌鼠组显著差异物种为Alphaproteobacteria和Oscillospirales等。以上结果表明性别差异对Cmah-/-小鼠肠道菌群组成结构造成了影响。除此之外，本研究中的相关性分析也显示了雄鼠组和雌鼠组中肠道菌群的相对丰度与炎症细胞因子的质量浓度之间的相关性存在差异。其中，值得注意的是，Helicobacter与雄鼠中SAA呈显著正相关，而与雌鼠中IL-6呈显著负相关，这可能也是提示了雄鼠和雌鼠通过特定肠道微生物调控小鼠体内炎症的机制不同。但将雄鼠和雌鼠分别进行数据分析，每个实验组只有3 个重复，存在样本量不足的缺陷，其致炎机制有待进一步的证实，将在下一阶段再进行深入的探究。
综上所述，PSM中的Neu5Gc激活了NF-κB信号通路，显著增加了小鼠炎性细胞因子IL-6、TNF-α和肝脏组织合成的急性反应蛋白SAA的表达水平。PSM中的Neu5Gc显著降低了雄鼠组中Muribaculaceae和Prevotellaceae的相对丰度，显著升高了Bacteroidetes和Firmicutes的相对丰度比值以及Clostridia UCG-014和Prevotellaceae_NK3B31_group等与肠道炎症呈正相关菌群的相对丰度；PSM中的Neu5Gc显著降低了雌鼠组中肠道菌群的丰富度，降低了Lachnospiraceae、Oscillospiraceae的相对丰度。由此表明，PSM中的Neu5Gc可能通过显著下调相关菌群的丰度，促进与肠道炎症呈正相关的菌群生长，导致肠道菌群结构紊乱，激活NF-κB信号通路，增加小鼠血清炎性细胞因子的分泌，从而促进Cmah-/-小鼠体内炎症反应，且其致小鼠炎症可能受性别因素的影响，Neu5Gc的致炎机制可能因性别因素而不同，有待进一步探讨。Neu5Gc与肠道菌群改变这二者之间对引发Cmah -/- 小鼠炎症反应的因果关系还需实验证实，以后将增加含有Neu5Gc的普通猪肉喂食组和不含有Neu5Gc的Cmah -/- 猪肉喂食组等实验组，分析Neu5Gc可能导致Cmah -/- 小鼠肠道菌群改变的机制。
本文《N-羟乙酰神经氨酸通过调节肠道菌群致小鼠的炎症机制》来源于《食品科学》2023年45卷第14期103-113页，作者：贺乐丽，刘楚鑫，肖 毅，沈清武，吴艳阳*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231018-145。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：天津商业大学 梁雯菁，责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。
长按或微信扫码进行注册
会议招商招展
联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）
热门跟贴