婴儿配方奶粉通过添加各种营养物质模拟人乳组成，人乳替代脂也以人乳脂为“黄金模板”。目前人乳脂替代品的主要制备方法是酶法合成。 在人乳替代脂的合成中，专一性脂肪酶作为合成反应的催化剂，作用至关重要。对专一性脂肪酶进行固定化，以提高其循环利用次数、保证其酶活力和专一性，是降低生产成本及其市场价格的主要途径。目前，人乳替代脂合成中普遍用到的催化剂是Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM。如表1所示，Lipozyme RM IM是来自 Rhizomucor miehei 的商业化固定酶，其固定化载体为离子交换树脂，由于其可循环利用度高和导致的副反应少而被广泛用于人乳替代脂的制备。表2主要总结了近些年来Lipozyme RM IM在合成人乳替代脂中的应用。

南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室的刘小如、颜佳、李静*等在前期研究基础上，探究了Lipozyme RM IM在同步合成主要成分为OPO和OPL的人乳替代脂过程中的循环利用特性，创新性地以中国母乳脂质数据库为依据，主要考察以sn-2高棕榈酸甘油三酯和游离脂肪酸为底物，Lipozyme RM IM催化循环利用次数对人乳替代脂中OPO和OPL含量、油酸和亚油酸含量、总棕榈酸含量、sn-2棕榈酸含量的影响，并深入探讨脂肪酶酶活力与其结构的关系。

1 人乳替代脂中OPO和OPL含量分析

母乳主要甘油三酯构型为OPO（8.86%～20.17%）和OPL（7.00%～19.15%）。如图1所示，本研究采用

sn
-2高棕榈酸甘油三酯和葵花籽油游离脂肪酸、高油酸葵花籽油游离脂肪酸进行反应，得到的产物甘油三酯中OPO的相对含量为19.41%，OPL的相对含量为17.04%，接近母乳OPO和OPL含量上限，表明本研究制备的人乳替代脂能够同时满足母乳中OPO和OPL含量要求。

随着酶循环次数的增多，人乳替代脂中OPO和OPL含量逐渐下降。说明随着脂肪酶循环利用次数的增加，脂肪酶的酶活力不断下降，进而导致OPO和OPL合成效率降低，含量也随之下降。这与已有研究得到的趋势一致，随着脂肪酶使用次数的增加，结构脂含量也呈现逐步下降的趋势。经过7 次循环后，OPL和OPO的含量显著下降（

P
＜0.05），这与脂肪酶活力显著下降有关。尽管如此，此时人乳替代脂产物中OPO和OPL含量仍然能够满足婴幼儿对OPO和OPL的需求。当脂肪酶循环利用至第18次时，产物中OPL和OPO的相对含量降至6.81%和8.51%，均不能满足母乳中OPL和OPO的含量要求。此时脂肪酶已经不再满足催化合成人乳替代脂的要求。

2 人乳替代脂中油酸、亚油酸、总棕榈酸分析

母乳总脂肪酸中占比最多的是油酸（27.74%～34.53%），其次是亚油酸（14.06%～23.00%）、棕榈酸（18.64%～22.46%）。本研究中初次合成的人乳替代脂中油酸（35.63%）、亚油酸（22.30%）和棕榈酸（28.80%）的相对含量均符合母乳要求或略高于母乳。

从图2可以看出，随着脂肪酶循环利用次数的增加，油酸和亚油酸的含量持续下降。这是因为随着酶活力的下降，油酸和亚油酸嵌入率降低，这与现有研究结果相似，其使用的Lipozyme RM IM在反应循环到第8次时，油酸的含量出现了较明显的下降。在同类脂肪酶Lipozym TL IM的循环利用研究中也出现了随着脂肪酶使用次数增加棕榈酸逐渐上升的结果。这是因为随着脂肪酶使用次数的增加，酶的酯交换能力下降，棕榈酸被取代的概率下降导致其含量升高。反应循环到第17次时，亚油酸相对含量下降至13.38%，此时虽低于母乳（14.06%～23.00%）下限但尚接近，且此时油酸相对含量仍在母乳含量范围（27.74%～34.53%）内，因此第17次循环利用仍有效。而继续循环到第18次反应时，亚油酸和油酸含量均进一步降低，已低出母乳数据库中含量范围，不符合母乳脂质要求。

3 人乳替代脂中sn-2棕榈酸分析

母乳中

s n
-2 脂肪酸相对含量最高的是棕榈酸（54.93%～66.11%）。通过此方法合成的人乳替代脂中的
sn
-2棕榈酸相对含量能达到52.40%，非常接近母乳需求。

由图3可知，随着脂肪酶使用次数的增加，

sn
-2棕榈酸含量一直上升，表明酶活力不断下降，甘油三酯中1,3位酯交换能力的下降造成了酰基迁移速率的下降，这与Novozym435脂肪酶稳定性的研究结果类似。Lipozyme RM IM循环使用18 次时，甘油三酯
sn
-2位棕榈酸的相对含量为60.15%，此时并未超出母乳中
sn
-2棕榈酸含量上限。

4 脂肪酶酯交换活力分析

固定化酶作为催化剂的一个重要优点是其可循环利用性。固定化酶的可循环利用性是衡量固定化酶性能优良和工业化应用的重要指标之一。然而，随着循环次数的增加，催化活性产生不可逆地降低，这可能是由于剧烈的机械搅拌和高温破坏了酶的结构。

从图4可知，随着循环次数的增加，Lipozyme RM IM活力逐渐降低，使用7 次后，酶活力开始出现显著性下降。循环第10次时酶活力是原来的86.35%。经过10 次循环使用后，结合前文OPL和OPO含量分析，脂肪酶仍有较好的催化效果。表明Lipozyme RM IM在本实验合成OPO和OPL中循环10 次依然能有较好的效果。当使用至第18次的时候，此时酶活力是原来的41.88%，尽管酶尚未完全失活，但是在这种情况合成产物中的OPO和OPL含量均不能满足婴幼儿的营养需求。在已有对Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM的循环利用研究中皆出现酶活力下降的趋势。根据酶活力变化的情况结合前文中各指标的描述，可以推断出Lipozyme RM IM在循环使用17 次时，合成的人乳替代脂依然能满足母乳脂质需求。此时人乳替代脂中OPO相对含量为8.50%，OPL相对含量为7.62%，总脂肪酸中油酸相对含量为28.62%，亚油酸相对含量为13.38%，总棕榈酸相对含量为38. 26%，

sn
-2棕榈酸相对含量为58.40%。但是Lipozyme RM IM循环使用超过17 次后，酶法合成产物脂质组成与中国母乳脂质范围相差甚远。事实上，影响固定化酶活力的因素较多，例如在使用过程中，尤其在回收过程中，酶存在一定程度上的损耗，且酶反应过程中有机底物本身对酶的蛋白质结构具有一定影响。

与现有对Lipozyme RM IM的循环次数研究相比，其只探究到酶使用到第10次时总油酸相对含量为37.41%，酶活力为初始酶活力的87.63%，未进行脂肪酶持续循环利用的系统验证；与已报道的循环9 次相比，其只单一的分析了油酸相对含量的变化，未有酶活力等其他指标。相比之下，本实验是以中国母乳脂质数据库为依据，增加了OPO与OPL含量、油酸与亚油酸含量、总棕榈酸含量、

sn
-2棕榈酸含量、酶活力等指标，采用多指标全方位系统的评价Lipozyme RM IM的循环利用次数，能够更加精准评价所合成人乳替代脂中各项指标与人乳指标的匹配度，分析的指标更全面，数据可靠性大大提高。

5 不同使用次数后的脂肪酶的CDS分析

蛋白质典型的CDS图在190 nm左右是正峰，在205～235 nm范围内是负峰。

-螺旋结构在增强稳定性方面发挥了重要作用，具有一定的刚性，对于一些蛋白质的整体构象起着支撑作用。如图5所示，随着脂肪酶使用次数的增加，负峰持续上移，说明酶的二级结构在发生改变。

如表4所示，随着使用次数的增加，Lipozyme RM IM 的二级结构中

-螺旋的相对含量显著降低（
P
＜0.05），如从未使用的0.108±0.006下降到第10次使用的0.058±0.003；无规卷曲从未使用的0.280±0.008上升到第10次使用的0.352±0.005，这与OPO和OPL含量的变化趋势一致。从整体来看，
-螺旋相对含量处于持续下降的趋势，而无规卷曲相对含量处于上升的趋势。当使用达到第18次时，
-螺旋相对含量仅为3%左右，而无规卷曲相对含量已经上升到了34%左右。随着酶活力的下降，酶的二级结构逐渐从有序状态变成了无序状态。这与现有研究中对Lipozyme RM IM的二级结构的描述结果类似。酶蛋白二级结构中的
-螺旋含量降低，肽链舒展，导致氨基酸残基暴露在疏水环境中，使蛋白质表面疏水位点增多，引起蛋白质表面疏水性增强，进而改变二级结构，影响酶活力，映证了稳定的二级结构与酶活力息息相关。

6 不同使用次数后的脂肪酶的内源荧光光谱分析

内源荧光光谱是产生是因为酶蛋白分子里含有芳香族氨基酸，这些氨基酸易受紫外线激发而发射荧光，所以常被用作内源发光体来研究蛋白质结构。通过检测其内源荧光光谱表征Lipozyme RM IM三级结构的变化。将激发光谱固定在280 nm处后获得的脂肪酶内源荧光发射光谱图如图6所示，在350 nm处出现了荧光发射峰。随着脂肪酶循环次数的增加，荧光强度逐渐增强，表明Lipozyme RM IM的三维结构逐渐发生变化。这是由于随着使用次数的增多，蛋白质的结构发生了改变，蛋白质包裹在内部的荧光发射基团逐渐暴露到外面，因此荧光强度逐渐增加，说明了脂肪酶在循环利用过程中其三维结构由有序状态变成无序状态。

结论

在人乳替代脂合成反应中，脂肪酶不可或缺，但价格昂贵。因此，脂肪酶的循环利用往往是降低生产成本的重要途径。本实验以Lipozyme RM IM脂肪酶为催化剂，采用

sn
-2高棕榈酸甘油三酯、葵花籽油游离脂肪酸和高油酸葵花籽油游离脂肪酸在间歇式反应器中进行酯交换反应同步合成人乳替代脂，并以OPO与OPL含量、油酸与亚油酸含量、总棕榈酸含量、
sn
-2棕榈酸含量、酶活力、脂肪酶二级结构信息和内源荧光强度等为指标，与中国母乳脂质数据库进行比对评价，测得Lipozyme RM IM在同步合成主要成分为OPO和OPL的人乳替代脂中最多可循环使用17 次，此时人乳替代脂中OPO相对含量为8.50%，OPL相对含量为7.62%，总脂肪酸中油酸相对含量为28.62%，亚油酸相对含量为13.38%，总棕榈酸相对含量38.26%，
sn
-2棕榈酸相对含量为58.40%。

反应条件、酶的种类以及所合成的人乳替代脂种类等因素，都会影响脂肪酶的循环利用次数。在回收的脂肪酶中补加新酶继续反应，或可获得更优效果，还需下一步验证。Lipozyme RM IM循环利用的研究不仅为脂肪酶在人乳替代脂合成应用中提供了参考，也为其他种类的人乳替代脂合成提供了重要依据。

作者简介

通信作者

李静，博士，教授，博士生导师。中国科协“十大”代表，江西省“赣鄱俊才”领军人才，江西省杰出人才，教育部学位中心学位论文评审专家。中国注册营养师，《动物源食品科学》杂志的副主编。《中国乳品工业》青年编委。中国营养学会食物与烹饪营养分会委员，中国营养学会益生菌分会委员，江西省营养学会副理事长，南昌市营养学会副会长兼秘书长，江西省营养学会科普分会副主任委员，江西省食品科学技术学会理事，江西省微量元素与健康研究会常务理事，江西省营养学会营养转化分会委员。

近年来获得江西省科技进步奖1 项，江西省科技发明奖1 项，中国产学研创新成果奖1 项，中国食品科学技术学会技术创新一等奖1 项，江西省教学成果奖1 项，南昌大学教学成果奖2 项，南昌大学第五届教师授课比赛二等奖，南昌大学第二届创新授课大赛二等奖。主讲课程《食品营养学》荣获国家一流线上课程，主讲课程《舌尖上的营养与健康》荣获江西省一流线上课程。参编教材《食品营养学》评为十二五规范教材，参编教材《功能食品学》评为卓越工程师教育培养计划食品科学与工程类系列规划教材。主持多项国家重点研发计划子课题、国家自然基金、教育部基金、省科技厅基金、省教育厅基金，食品科学与技术国家重点实验室基金。主持、参与并完成伊利、澳优、益海嘉里、无限极等企业横向课题50余项。发表论文100余篇，其中SCI 80余篇。申请专利24 项，授权专利12 项。

研究方向：油脂加工与健康
学习经历:1999年9月-2003年6月：南昌大学生命科学与食品工程学院，本科；2003年9月-2009年7月：南昌大学生命科学与食品工程学院，硕博连读；2007年12月-2008年12月：加拿大农业部Guelph食品研究中心联合培养博士。工作经历:2009年7月-2012年12月：南昌大学生命科学与食品工程学院，讲师；2012年12月-2018年12月：南昌大学食品学院，副教授，硕导；

2019年1月至今，南昌大学食品学院，教授，博导。

第一作者

刘小如，博士，副研究员，硕士生导师，南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室固定研究成员，赣江青年学者，加拿大农业食品部访问研究员。中国注册营养师，江西省营养学会常务理事兼副秘书长。主要研究方向：油脂、天然产物营养及食品加工产业化应用。近年来主持国家自然科学基金3项、中国科协、中国农技协项目等课题20余项；发表SCI论文30余篇；Food Research International，Food Control,Food bioscience等杂志审稿人；授权专利2 件；参编十三五国家规划教材；讲授研究生及本科生专业课4 门，其中《食品营养学（双语）》获批教育部国家级一流课程、并获江西省教学成果奖、南昌大学优秀班级导师、优秀毕业论文指导教师等。

本文《Lipozyme RM IM在人乳替代脂合成中的循环利用及结构变化》来源于《食品科学》2024年45卷第14期60-66页，作者：刘小如，颜 佳，谭登峰，邓泽元，李 静。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231101-003。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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