《食品科学》：广东海洋大学钟赛意教授等：砷脂促进秀丽隐杆线虫衰老的毒性效应及其分子机制

砷（As）是一种类金属元素，主要以无机砷（iAs）和有机砷（oAs）形式存在于环境中，其毒性取决于其形态。iAs被国际癌症研究机构列为强致癌物，具有高毒性、致癌性、致畸性等。常见的oAs包括甲基砷、砷脂、砷糖、砷甜菜碱和砷胆碱等。砷脂是一类结构复杂、具有亲脂性的有机砷化合物的总称。一般认为oAs是无毒的，但随着研究的深入，发现砷脂具有一定的细胞毒性、发育毒性、神经毒性等。人类主要通过海产品接触砷脂，其饮食积累对机体产生的影响未知。

衰老是生命体随着年龄增长而出现一些生理功能上退化的过程，环境污染物暴露会促使机体过早衰老，引发多种退行性病变 。研究食源性污染物对生物体衰老效应及作用机制成为毒理学和食品安全的热点。 秀丽隐杆线虫（

Caenorhabditis elegans

广东海洋大学食品科技学院的尹欢、宋兵兵、钟赛意*等以秀丽隐杆线虫为体内模型，研究常见于海产品中不同分子质量砷脂对线虫寿命等生理指标和生化指标的影响，测定砷脂对线虫DAF-16蛋白表达情况和daf-16突变株寿命的影响，检测衰老和氧化相关基因的相对表达水平，分析其影响线虫寿命的可能机制，在一定程度上丰富砷脂毒理学数据，为评估海产品中砷脂暴露对人类的健康风险提供科学依据。

1 砷脂对线虫致死率的影响

首先评估砷脂和亚砷酸钠（NaAsO2）急性暴露（24 h）对线虫的中位数致死浓度（lethal concentration 50，LC50）（图2）。随着浓度增加，AsHC 332和AsHC 346对线虫致死率逐渐升高，而AsHC 374不影响线虫致死率；NaAsO2对线虫的致死率升高，5 mmol/L时致死率达到100%。

AsHC 332、AsHC 346和NaAsO2处理后L4期线虫的LC50分别为2.068、5.755 mmol/L和1.544 mmol/L（表2）。因此，选择AsHC 332、AsHC 346作为样品，0.1、0.5、1 mmol/L作为亚致死率浓度进行后续实验。

2 砷脂对线虫体长、体宽、头部摆动频率和后代数目的影响

砷脂暴露显著降低了线虫体长、体宽，呈现浓度依赖性。与空白组相比，高浓度（1 mmol/L）条件下AsHC 332和AsHC 346暴露分别导致线虫体长减少了16.04%和15.58%（P＜0.001）（图3A），体宽减少了23.51%和24.36%（P＜0.001）（图3B）。随着浓度增大，砷脂暴露导致线虫的头部摆动频率显著降低；在1 mmol/L浓度下，与空白组比较，AsHC 332暴露线虫头部摆动频率与AsHC 346暴露组有显著性差异（P＜0.001）（图3C）。各浓度AsHC 332暴露均导致线虫后代数目显著降低，而AsHC 346只有在高浓度（1 mmol/L）暴露条件下才会导致线虫后代数目显著降低（P＜0.05）（图3D）。结果表明，砷脂抑制了线虫的生长发育，降低了线虫头部摆动频率和后代数目，且高浓度AsHC 332暴露降低线虫的头部摆动频率程度大于AsHC 346暴露组。

3 砷脂对线虫抗压能力的影响

线虫对热应激和紫外应激的抵抗能力可以反映线虫本身的适应调节能力。由表3及图4A、B可知，35 ℃热应激后，空白组线虫的平均寿命为（13.50±0.35）h，与空白组相比，AsHC 332和AsHC 346暴露导致线虫的平均寿命显著降低，在0.1、0.5、1 mmol/L浓度暴露条件下分别降低了17.78%、20.73%、20.55%和17.42%、11.24%、16.07%（P＜0.000 1）。但与阳性对照组相比，两种砷脂对线虫热应激后的平均寿命均无显著差异。紫外应激1 h后，空白组线虫的平均寿命为（12.46±0.35）d（表4），砷脂暴露后线虫寿命曲线左移（图4C、D）。1 mmol/L浓度时，AsHC 332和AsHC 346暴露后的线虫平均寿命分别为（10.88±0.43）d和（11.41±0.42）d，表明砷脂暴露降低了线虫在紫外线胁迫后的平均寿命。结果表明，砷脂暴露减弱了线虫对热应激和紫外应激的抵御能力。

4 砷脂对线虫寿命的影响

寿命是衰老的一个常见指标，可以反映污染物暴露的长期影响。为研究砷脂暴露对线虫寿命的影响，每天检查砷脂暴露线虫的存活数量，直到所有线虫死亡。结果表明（图5），与空白组相比，寿命曲线显著左移的趋势，空白组线虫平均寿命为（15.18±0.09）d，高浓度（1 mmol/L）AsHC 332和AsHC 346暴露组寿命分别为（11.78±0.31）d和（12.48±0.28）d（P＜0.000 1），分别降低了22.37%和17.82%（表5）。结果表明，砷脂暴露后显著缩短了线虫平均寿命。

5 砷脂对线虫脂褐素积累的影响

脂褐素是细胞内荧光色素颗粒，其积累随年龄增大而增加，也指示衰老细胞内由氧化应激引起的细胞损伤。与空白组相比，暴露于中高浓度（0.5、1 mmol/L）砷脂条件下的线虫脂褐素含量显著增加（图6），AsHC 332和AsHC 346暴露组分别增加了29.72%、46.11%和23.77%、36.92%（P＜0.001）。而在1 mmol/L浓度下，AsHC 332与AsHC 346相比，线虫脂褐素含量有显著性差异（P＜0.05）。结果表明，砷脂促进了线虫脂褐素积累，可能造成氧化损伤。

6 砷脂对线虫DAF-16蛋白核定位的影响

利用稳定表达DAF-16::GFP融合蛋白的转基因菌株TJ356检测砷脂是否影响DAF-16蛋白核定位（图7）。空白组线虫显示出低水平的DAF-16核定位（18.7%），主要存在细胞质和核间质中。AsHC 332和AsHC 346暴露呈现核定位的线虫比例分别增加至23.0%和22.8%（P＞0.05）。结果表明，高浓度砷脂暴露对DAF-16蛋白核定位促进作用不显著。

7 砷脂对

daf-16(mu86)

突变株寿命的影响

为进一步探究砷脂缩短线虫寿命可能机制，测定了砷脂暴露对突变株CF1038寿命的影响（图8）。空白组突变株平均寿命为（13.24±0.45）d，高浓度AsHC 332和AsHC 346暴露后突变株CF1038的平均寿命分别为（13.40±0.17）d和（13.24±0.54）d，与空白组相比没有显著性差异（表6），表明砷脂暴露不能缩短daf-16(mu86)突变株的寿命。

8 砷脂对

daf-16下游基因相对表达量的影响

为研究砷脂缩短线虫寿命的分子机制，检测了衰老相关基因（daf-16）、金属硫蛋白基因（mtl-1）、超氧化物歧化酶基因（sod-3）、过氧化氢酶基因（ctl-1）、谷胱甘肽-S-转移酶基因（gst-4）、热激蛋白基因（hsp-16.2）的表达量（图9）。结果发现，砷脂暴露后，在线虫早期阶段（第3天），daf-16基因表达增加但不显著（P＞0.05），sod-3、mtl-1、ctl-1、gst-4和hsp-16.2基因表达量均显著增加（P＜0.05）。进入衰老期阶段（第8天），只有mtl-1基因表达量下降（P＞0.05），其余基因表达量显著增加（P＜0.05），但与第3天相比，大部分基因的表达量变化幅度小。

本研究测定了砷脂暴露对线虫的致死率，0～1 mmol/L的浓度范围内，3种砷脂的毒性大小为AsHC 332＞AsHC 346＞AsHC 374。这可能是由于AsHCs烃链越短，越容易通过细胞膜进入细胞中并在线虫体内积累，从而对线虫造成的毒性越大。线虫对毒性较低的污染物敏感。0.1 mmol/L砷脂暴露抑制了线虫的生长发育、降低了其繁殖能力和运动能力。Bornhorst等研究发现砷脂延迟了线虫的生长发育，可能是因为AsHCs具有两性结构，其易与亲脂结构相互作用，通过线虫角质层或被线虫肠道吸收。本研究结果表明，砷脂暴露对线虫产生了发育毒性、生殖毒性和神经毒性，促进了其脂褐素积累，减弱了抗应激能力，进而促进线虫衰老。前人研究表明，丙烯醛和三唑醇等污染物也会降低线虫的后代数目、体长、体宽和头部摆动频率，产生氧化应激反应，缩短线虫寿命，并影响衰老。重金属污染的土壤渗滤液会引起线虫体内应激反应，产生大量活性氧，缩短线虫寿命。因此，猜测砷脂暴露后可能诱导了线虫产生氧化应激反应，从而缩短线虫寿命。

转录因子DAF-16是IIS的主要靶点。高浓度砷脂暴露促进DAF-16蛋白的核定位效果不显著。实时PCR结果表明，daf-16基因在第8天线虫中表现出更高表达水平，表明DAF-16蛋白在线虫衰老初期被激活。随后检验了砷脂是否影响daf-16(mu68)突变株的寿命，结果发现，daf-16基因沉默后，砷脂不能缩短daf-16(mu86)的寿命，表明砷脂降低线虫的寿命可能依赖于daf-16基因的表达。前人研究表明，在线虫成虫第7天时DAF-16核定位增多，代表DAF-16蛋白激活，这可能是由于打破了蛋白质稳态，诱导各种热休克蛋白的表达。不同毒物对daf-16(mu86)突变株平均寿命的影响不同，可能与毒物暴露方式、暴露时间以及线虫暴露阶段有关。与Zhao Yunli等研究结果相反，其对线虫L1期进行氧化石墨烯（graphene oxide，GO）溶液暴露48 h，相同暴露条件下，daf-16(mu86)突变株与野生型线虫相比表现出显著寿命缩短，结果表明daf-16敲除后导致线虫对GO毒性更敏感。对于重金属镉（Cd）暴露后的daf-16(mu86)，其在热应激（35 ℃）预处理和非热应激（20 ℃）条件下LC5048h无显著差异，表明DAF-16转录因子是热应激诱导的Cd抗性所必需的。

为进一步探究砷脂暴露促进线虫衰老的分子机制，检测了转录因子DAF-16的下游靶标表达水平。高浓度砷脂暴露导致第3天线虫体内的 sod-3 、 gst-4 、 hsp-16.2 、 mtl-1 、 ctl-1 基因显著上调，其中前三者相对表达量幅度影响大。 hsp-16.2 基因的高表达会造成线虫体内出现热休克反应，从而导致蛋白质的折叠出现错误，这解释了砷脂暴露减弱了线虫抵抗热应激能力。 sod-3 和 hsp-16.2 基因通过上调应对砷脂对线虫造成的氧化损伤，即使 gst-4 基因上调，但损伤超过线虫自身耐受程度，防御机制减弱，导致线虫无法通过谷胱甘肽- S -转移酶结合产物抑制各种氧化应激。为探究线虫衰老程度是否对应激基因的表达量有影响，测定了第8天线虫的基因相对表达。结果表明，进入衰老期阶段（第8天），只有金属硫蛋白 mtl-1 表达量下降，其他基因表达量显著增加，但与第3天相比，基因上调幅度小，可能是随着时间的延长，线虫对砷脂带来的毒性效应产生了适应性反应。与严晨之等 的研究结果一致，亚急性邻苯二甲酸二乙酯暴露后， sod-3 和 hsp-16.2 基因上调，表明线虫体内抗氧化防御系统被激活。1/5 LC50对羟基苯甲酸酯暴露后，氧化应激反应基因s od-3 、 ctl-2 、 gcs-1 、 gst-4 、 hsp-16.2 和 hsp- 70明显上调，可能通过氧化应激介导对羟基苯甲酸酯对线虫的生态毒性 。而Zhang Ying等 研究发现，铜暴露后线虫体内活性氧增加，抑制了 mtl-1 、 ctl-1 、 ctl-2 、 gst-4 、 hsp-16.1 和 hsp-12.6 基因的表达，导致线虫对铜的解毒能力下降，氧化应激和其他应激的防御能力下降，从而影响健康和寿命。本研究表明砷脂暴露会明显提高线虫胁迫相关基因表达量，这可能是线虫维持稳态的一种响应，进而保护自身免受外源污染物毒害。

结论

本研究中AsHC 332对线虫致死率的毒性大于AsHC 346，而两种砷脂对线虫的寿命和其他健康指标毒性效应基本相同。砷脂降低了线虫的平均寿命，增加了脂褐素积累，并通过损伤与其衰老相关的生理指标和降低应激能力，从而促进线虫衰老进程。砷脂暴露上调了线虫daf-16、sod-3、ctl-1、gst-4和hsp-16.2基因相对表达，对第3天线虫DAF-16蛋白迁移从细胞质至细胞核作用不明显，但随着线虫年龄增加，daf-16基因相对表达量升高。与空白组相比，高浓度砷脂暴露对daf-16(mu68)突变株的寿命无影响，暗示砷脂可能在降低线虫寿命和抗逆性方面依赖于DAF-16转录因子调节。除了IIS之外，DAF-16蛋白的激活可能原因有热、氧化应激和饥饿等信号调节，而砷脂缩短线虫寿命的潜在机制仍有待进一步研究。

作者简介

通信作者：

钟赛意，广东海洋大学食品科技学院，副院长，博士研究生导师，博士后合作导师，广东海洋大学南海杰出学者，现任广东海洋大学科学技术部副部长，广东省水产品加工与安全重点实验室常务副主任，广东省海洋生物制品工程实验室副主任，海洋食品营养与功能因子研究与开发省级科技创新团队负责人，兼任广东海洋协会海洋生物分会副会长、广东省食品学会理事、中国预制菜产业联盟专家委员会专家、国家农产品加工科技创新联盟预制菜专业委员会专家、深圳全球海洋中心城市建设促进会专家委员专家、国际期刊《Frontiers in Nutrition》《Food Technology and Nutrition Sciences》《Food Science of Animal Products》以及《广东农业科学》《食品科学技术学报》等杂志编委/青年编委，《Polymers》《Marine Drugs》等SCI期刊客座编辑。2011年博士毕业于中国农业大学与美国The Ohio State University联合培养项目（国家公派留学）。曾参与美国国立卫生研究院（NIH R01）、欧盟第六框架科技计划、美国农业部等资助项目的研究工作。现主要从事海洋生物活性物质研究与开发、特色农产品营养与功能化开发等方面的研究工作。近年主持国家自然科学基金、国家重点研发计划子课题、广东省重点研发、广东省海洋渔业科技发展专项、深圳市科技计划等项目20多项。在国内外学术期刊发表论文100多篇，其中SCI/EI收录80余篇，ESI高被引/热点论文5 篇，封面论文1 篇，授权国际和国内发明专利20多项，主持或参与制修订地方及团体标准10 项，主编教材1 部，主持获广东省科技进步二等奖、全国商业科技进步奖一等奖、三等奖、广东省农业技术推广奖二等奖、全国商业科技服务创新奖一等奖等科技奖励5 项。

第一作者：

尹欢，中共党员，食品科技学院食品科学与工程专业2021级硕士研究生，主要从事砷脂的毒性研究。曾任学院党务联络部食品科学与工程专研究生分部副部长。曾获学业二等奖学金、优秀研究生等。

本文《砷脂促进秀丽隐杆线虫衰老的毒性效应及其分子机制》来源于《食品科学》2024年45卷第23期131-139页，作者：尹欢，宋兵兵，黎梓玉，汪卓，赵巧丽，李瑞，陈建平，钟赛意。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231226-227。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：陈丽先；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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