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Introduction

近年来，随着生活观念愈加健康化，植物蛋白饮料以其纯植物源性、不含乳糖和胆固醇、富含蛋白质、膳食纤维、天然维生素和矿物质等优点，越来越受到消费者的钟爱。其中杏仁和核桃饱含丰富的不饱和脂肪酸、钙和钾等营养物质，故杏仁露和核桃露在植物蛋白饮料中占据巨大的市场份额。然而杏仁和核桃的价格略贵，不法商家多使用价格更为低廉的大豆和花生代替其加入配料中，获取利益。这种掺假行为不仅损害消费者权益，饮料中隐性坚果过敏原的存在，对易过敏患者也造成潜在的威胁。因此，建立一种快速高效的植物蛋白饮料掺假鉴别方法具有重要的实际意义。

植物蛋白饮料的掺假鉴别方法目前主要有两类方法。一种是使用PCR技术鉴别核桃露中的花生成分，但涉及引物合成和DNA提取等繁琐程序，复杂而耗时。另一种是使用大豆异黄酮作为指示剂来检测核桃露中的大豆成分，该方法准确性低，因为大豆中的大豆异黄酮含量会在加工过程发生损失变化。

本研究基于过敏原特征肽段首次采用UPLC-MS/MS方法对植物蛋白饮料掺假进行高通量检测。此方法不仅可以有效控制植物蛋白饮料市场掺假乱象，保护消费者权益，还可以降低坚果过敏消费者的健康隐患，规范过敏原标签信息管理。

Results and Discussion

特征肽段的选择

开发定量MRM方法的关键步骤是合理的选择特征肽段。首先，通过NanoLC-Triple TOF MS高分辨质谱对生的杏仁、花生、核桃或大豆的酶解液进行分离分析，结合Uniprot蛋白数据库使用ProteinPilotTM软件对获取的MS图谱进行匹配分析。在匹配成功的蛋白中分别为杏仁、花生、核桃和大豆选择两种主要的且含量丰富的过敏原蛋白，并分别为每种过敏原蛋白选择了两个具有高丰度和可重复性的特征肽段。经筛选后，选择出8种过敏原蛋白和16条特征肽段。

MRM参数优化

用0.1％甲酸水分别将16条特征肽段稀释至5 μg/mL，通过蠕动泵以5 μL/min的速率直接注入Qtrap 6500质谱仪中。通过全扫描模式确定特征肽段的前体离子质量数，再通过产物离子扫描从产物离子中选择两个稳定且灵敏度高的特征离子，以建立MRM离子对。在MRM模式下优化各特征肽段的去簇电压和碰撞能。

方法学验证

杏仁、花生、核桃和大豆的每条定量特征肽段在线性范围内均表现出良好的线性关系，R2＞0.99403。在3个加标浓度水平上，杏仁的平均回收率为85.43％～109.38％；花生的平均回收率为97.97％～110.44％；核桃的平均回收率为88.32％～105.64%；大豆的平均回收率为84.77％～106.73％，且RSD均低于15％。最终，分别选择GNLDFVQPPR（Prunin 1）、DLAFPGSGEQVEK（Ara h 1）、DFLAGQNNIINQLER（Jug r 2）和LITLAIPVNKPGR（Gly m 5）作为杏仁、花生、核桃和大豆的定量肽段。各物种的定量限（以g杏仁、花生、核桃或大豆/L植物蛋白饮料表示）分别为：杏仁0.015 g/L；花生0.01g/L；核桃0.5 g/L；大豆0.05 g/L。

杏仁、花生和核桃之间的相互检测干扰

市售的植物蛋白饮料中通常含有不止一种植物成分，杏仁、核桃和花生仁是最为常见的主要成分，其各成分之间是否存在检测干扰也未可知。本实验使三者相互混合，以回收率作为指标，评估杏仁、花生和核桃之间的相互检测干扰。结果如图1所示，三者之间的相互检测干扰均低于20％；与此同时，三种坚果相互混合之后，其绝对回收率仍在80％～120％之间。故三种坚果之间的相互检测干扰满足实验可接受的重复范围值之内，并不影响定量检测结果。

实际样品测定

采用本研究建立的UPLC-MS/MS方法同时检测31批市售植物蛋白饮料样品。17批杏仁露中，2批未检测到杏仁成分，未检出率为11.76%；12批核桃露中，2批未检测到核桃成分，未检出率占16.67%。这表明杏仁露及核桃露标签信息中存在虚假现象，对市场标签管理具有警告意义。

花生和大豆饮料价格较低，通常不存在掺假，但不法商家为了降低成本可能会将花生或大豆代替杏仁或核桃加入杏仁露及核桃露中，这大大增加了花生和大豆易敏人群的风险。结果表明，17批杏仁露中，样品1、5检出花生成分；12批核桃露中，样品18、29检出花生成分。其中，1号和5号杏仁露中的花生浓度（（0.37±0.016）、（0.13±0.021）g/L）相对较低，可能是生产中无意的交叉污染，所占比例为6.90%。但18号和29号核桃露样品中的花生含量分别高达（14.63±0.17）g/L和（7.27±0.15）g/L，明显存在掺假现象，掺假率为6.90%。在30批样品（不含大豆成分）中，只有14号核桃露样品检出大豆成分，故其掺假率为3.33%。尽管一些制造商标识了过敏原信息，但其掺假的坚果信息不会明示。因此，本研究中建立的检测方法不仅对植物蛋白饮料质量的市场监管提供技术支持，过敏原标签信息的管理也具有重要意义。

Conclusion

本研究开发了一种基于蛋白质组学的新型UPLC-MS/MS植物蛋白饮料掺假检测方法。该方法具有操作简洁、高特异性、高灵敏度和高通量等优点，成功应用于31种市售植物蛋白饮料。结果表明，核桃露和杏仁露的自身成分未检出率分别为11.76%和16.67%，花生和大豆的掺假率分别为6.90%和3.33%，花生的交叉污染率为6.90%。本研究以期为植物蛋白饮料的质量控制和过敏原标签信息的管理提供有效的技术支持，保护消费者权益和健康。

通信作者

01

李强，正高级工程师，河北省“三三三人才工程”二层次人选，河北省特殊津贴专家。主要从事食品安全检测技术研究、大型分析仪器方法开发及应用，科研成果获河北省科学技术进步奖二等奖2 项，获中国商业联合会科学技术奖特等奖1 项、二等奖1 项、三等奖2 项。发表SCI/EI等高水平学术论文50余篇。主持国家“十三五”国家重点研发计划任务1 项，河北省“三三三人才工程”资助项目1 项，国家市场监管总局科技项目2 项。

02

张岩，河北省食品检验研究院副院长，研究员，博士生导师，享受国务院特殊津贴专家，河北省杰出专业技术人才，国家市场监督管理总局科技创新领军人才，河北省“三三三人才工程”第一层次人选，河北省青年拔尖人才。相关研究成果获国家市场监管科研成果一等奖（第一完成人）和中国商业联合会科技进步特等奖（第一完成人）等省部级科技奖励34 项（第一完成人12 项）。主持国家自然科学基金面上项目、国家重点研发计划课题等国家级项目7 项，省部级科研项目12 项，授权国家发明专利19 项、软件著作权17 项，发表SCI论文98 篇，其中IF≥5的50篇，制修订国家标准43 项、行业标准14 项、地方标准65 项。

Adulteration detection of plant protein beverages by UPLC-MS/MS based on signature peptide of allergen

Yawei Ninga, Zhuo Liua,b, Zheng Yanga,b, Junmei Mab, Yan Zhangb,c,*, Qiang Lib,*

a College of Food Science and Biology, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China

b Hebei Food Inspection and Research Institute, Hebei Food Safety Key Laboratory, Key Laboratory of Special Food Supervision Technology for State Market Regulation, Hebei Engineering Research Center for Special Food Safety and Health, Shijiazhuang 050000, China

c Hebei Key Laboratory of Forensic Medicine, College of Forensic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China

*Corresponding author.

Abstract

Plant protein beverage adulteration occurs frequently, which may cause health problems for consumers due to the hidden allergens. Hence, a novel method was developed for authentication by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Almond, peanut, walnut and soybean were hydrolyzed, followed by separation by NanoLC-Triple TOF MS. The obtained fingerprints were identified by ProteinPilotTM combined with Uniprot, and 16 signature peptides were selected. Afterwards, plant protein beverages treated by trypsin hydrolysis were analyzed with UPLC-MS/MS. This method showed a good linear relationship with R2 > 0.99403. The limit of quantification (LOQ) were 0.015, 0.01, 0.5 and 0.05 g/L for almond, peanut, walnut and soybean, respectively. Mean recoveries ranged from 84.77% to 110.44% with RSDs < 15%. The developed method was successfully applied to the adulteration detection of 31 plant protein beverages to reveal adulteration and false labeling. Conclusively, this method could provide technical support for authentication of plant protein beverages to protect the rights and health of consumers.

Reference:

NING Y W, LIU Z, YANG Z, et al. Adulteration detection of plant protein beverages by UPLC-MS/MS based on signature peptide of allergen[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3371-3380. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250022.

本文编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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