烟酰胺单核苷酸（NMN）是一种天然产生的生物活性核苷酸，它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）的前体。因此，NMN与NAD＋的代谢相关。研究结果表明，口服NMN可使人体内NAD＋水平增加60%，且能够有效避免NAD＋下降所引起的各种疾病，减缓人体细胞衰老。

利用生物酶法合成NMN成为常用方法。生物酶法合成具有底物专一性强、催化效率高、反应条件温和、环境友好等优点，因此烟酰胺核糖苷（NR）在烟酰胺核糖激酶1（NRK1）的催化下转化为

-NMN是合成NMN的首选方法 。在ATP提供能量以及金属离子Mg 2＋ 的参与下，NRK1将NR特异性催化成
-NMN。 工业应用中通常会需要或遇到高于45 ℃的高温环境，高温使酶发生不可逆的失活，限制了NMN的工业化生产 。因此，提高此酶的最适温度及热稳定性成为本研究的焦点。

通过理性设计策略和定点突变的酶分子改造技术可有效提高酶分子的稳定性，已被广泛应用于多种酶的稳定性提升研究。温度因子B主要是体现晶体中原子构象状态的一种模糊度，反映了蛋白质分子在晶体中的构象状态，B因子越高模糊度越大，相应部位的构象就越不稳定。通过计算相应氨基酸残基的因子值，可以分析氨基酸残基的构象稳定性或其柔性。FoldX和Rosetta这两种方法都是通过计算突变体的自由折叠能预测突变体稳定性。

南阳师范学院生命科学学院的王瑶、沈太松、唐存多*等借助AlphaFold2在线软件将

Sc
NRK1进行同源建模，接着将同源建模后的
Sc
NRK1三级结构模型交至FireProt 2.0软件进行定点饱和突变，根据B因子分析，同时利用FoldX和Rosetta的阈值进行虚拟突变，再借助全质粒扩增的定点突变技术获得突变体编码基因，诱导表达后进行筛选获得较好的单点突变体，随后对单点突变体进行组合突变，进而获得酶活性及热稳定性均显著提高的组合突变体。最后，再基于酶分子的结构和分子间相互作用力的分析，探索突变体热稳定性及酶活性提高的分子基础。

1 ScNRK1突变体的构建与筛选

使用AlphaFold2在线软件将ScNRK蛋白序列进行同源建模，选择最优的三级结构构象进行进一步分析（图2），将同源建模后的ScNRK1三级结构模型提交至FireProt 2.0软件进行定点饱和突变，筛选出6 个突变体T85F、T85Y、N134C、T136P、D119Y、S209A。

2 突变酶重组表达工程菌株的构建

根据表1设计的引物，按照1.3.2节中的方法进行两轮PCR。最终得到重组质粒pET28a-ScNRK1的PCR突变产物，再转入大肠杆菌感受态细胞中培养得到单菌落。送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，成功获得突变酶重组表达工程菌株。

3 突变体的表达和纯化

选取ScNRK1及其酶活力提升的突变体诱导表达，收集菌液，离心，破碎后收集上清液及纯化。如图3所示，突变体酶粗酶液和纯化后的酶液在27 kDa处均有明显条带，表明突变体酶成功表达，且纯化后的条带单一无杂带，表明获得了纯的突变体ScNRK1。

4 NMN标准品的定量分析

按照1.3.5节的方法将NMN标准品进行HPLC分析，在该分析条件下，NMN的保留时间约为2.82 min，将NMN不同浓度对相应的峰面积进行线性拟合，得到NMN的标准曲线方程为y＝2 123.3x＋3.352 8，R2＝0.999 8，NMN不同浓度与其相对应的峰面积有良好的线性关系，可以利用色谱对产物NMN进行精确定量。同样条件下对底物NR进行HPLC分析，底物的保留时间约为3.79 min。在相同的分析条件下，NMN与底物NR的保留时间差约0.97 min，结果表明在该色谱条件下能够实现NMN和NR的良好分离，能够用于催化产物的分析鉴定。

5 不同突变体的相对酶活力

如图4所示，突变体D119Y、T136P、S209A的相对酶活力均高于野生型ScNRK1，筛选这3 个位点使用定点突变技术再次进行新一轮的组合突变，通过诱导表达鉴定后得到组合突变体T136P/S209A，其比活力为146.63 IU/mg，是野生型ScNRK1的1.98 倍。

6 不同温度对酶活性和稳定性的影响

如图5A所示，野生型酶的最适反应温度为30 ℃，与文献报道的最适温度一致。单点突变体D119Y的最适温度提高至35 ℃，单点突变体T136P和S209A的最适温度均提高至40 ℃。如图5B所示，组合突变体D119Y/T136P和D119Y//S209A最适温度分别为35 ℃和40 ℃，组合突变体T136P/S209A的最适温度为45 ℃，与野生型酶相比提升了15 ℃。由图5C可知，野生型酶的半衰期为11.77 min，且在60 min时野生型剩余酶活力为15.99%；而3 个单点突变体较野生型的半衰期均有一定的提高。由图5D可知，组合突变体T136P/S209A的热稳定性最高，其半衰期提高至48.98 min，是野生型的4.2 倍，且在60 min时仍保留43%的酶活力。

7 ScNRK1的结构分析

为了比较ScNRK1与T136P/S209A突变体的热稳定性和活性方面的结构差异，采用AutoDock Vina软件将ScNRK1和T136P/S209A突变体分别与底物小分子NR进行分子对接。从图6A可以直观地看出ScNRK1上Gln166、Arg159、Tyr42、His89这4种氨基酸与NR形成了4 个氢键，由图6B可知，组合突变体T136P/S209A中的Gln166、Arg159、Tyr42、His89、Asp39与NR结合形成了6 个氢键。T136P/S209A与底物结合时比野生型多形成2 个氢键，也增加了一个与底物结合的氨基酸残基，氢键增多使突变体酶的结构更加稳定，这可能是其热稳定性提高的原因。与小分子结合的氨基酸数量增加使得突变体酶的结构更加紧密，同时解释了突变体酶活力较野生型升高的现象。

利用Ligplot软件分析了野生型和突变型酶的疏水相互作用。由图7可知，在野生型酶与底物结合过程中，Gly18、Arg158、Ser16、Ile223氨基酸残基与NR形成了疏水相互作用，而突变型酶中Asp219、Thr221、Thr21与底物形成了3种额外的疏水相互作用。将这些残基对应于三维空间模型，可以发现这些氨基酸残基在催化中心形成了一个疏水性口袋，底物被包裹在口袋中。因此，组合突变体T136P/S209A表现出更强的疏水相互作用。在催化过程中酶分子之间的疏水相互作用增强，导致T136P/S209A的热稳定性提高。

8 讨论与结论

酶法合成精细化学品具有高效催化、条件温和、绿色合成、副产物少等优点，使得酶法合成在化学化工、生物医药、食品科学等领域具有广阔的应用前景，酶法合成作为绿色、可持续的化学合成方法受到越来越多学者的青睐。NRK1作为NMN生物合成的关键酶，它的最适反应温度较低、热稳定性较差，常常不能满足生产过程中的高温环境。因此，本研究聚焦于提高NRK1的热稳定性，以

Sc
NRK1为研究对象，基于之前对NRK1的结构分析和催化机制研究，通过理性设计的策略对酶活性中心进行改造以提高酶的最适温度和热稳定性。首先通过AlphaFold2将
Sc
NRK1进行同源建模，使用FireProt软件将建模的三维结构进行虚拟饱和突变，通过B因子分析，同时利用FoldX和Rosetta的阈值设计出6 个突变体：T85F、T85Y、N134C、T136P、D119Y、S209A，并成功构建出突变体表达工程菌株。通过诱导表达和酶学性质分析，筛选出酶活性提高的3 个突变体（D119Y、T136P、S209A）进行组合突变，最终得到最适温度和热稳定性均提高的组合突变体T136P/S209A，T136P/S209A的最适反应温度为45 ℃，在45 ℃条件下的半衰期为48.98 min，是野生型的4.2 倍，且纯化后突变体酶的比活力为146.63 U/mg，较野生型的比活力提高1.98 倍，而与此前同类研究相比，突变体的比活力提高了23 倍 ，具有较好的应用潜力。

为了探究组合突变体T136P/S209A热稳定性提高的原因，本研究采用AutoDock软件将

Sc
NRK1和T136P/S209A突变体分别与底物小分子NR进行分子对接。T136P/S209A和底物结合时比野生型多形成2 个氢键。氢键作为蛋白最重要的非共价相互作用力，对蛋白质二级、三级结构的维持起到关键作用 ，氢键增多使突变体酶的结构更加稳定 ，这可能是热稳定性提高的原因；同时增加了一个与底物结合的氨基酸残基，与小分子结合的氨基酸数量增加使得突变体酶的结构更加紧密 ，这可能是突变体酶活力较野生型酶活力升高的原因。

此外，蛋白质之间的相互作用也是影响蛋白质热稳定性的关键因素之一，所以本实验利用Ligplot软件分析了野生型酶和突变体酶的疏水相互作用。结果显示，突变型酶中的氨基酸残基与底物小分子之间形成了3种额外的疏水相互作用，这可能导致T136P/S209A的热稳定性提高。

综上所述，本研究基于理性设计的手段，成功设计出催化活性高、热稳定性增强、最适温度提高的突变体T136P/S209A。本研究有望提高NMN的生物产能，对NMN的工业应用具有积极意义，为NMN的高效、低成本生产提供新酶源，也为未来大规模工业化生产NMN提供借鉴。此外，通过酶的结构分析，加深了对生物酶改造的理解，也为改造生物酶提供了新思路。

作者简介

通信作者：

唐存多，男，1987年4月出生，湖南永州人，2008年6月毕业于苏州科技大学，获生物技术专业理学学士学位，2014年1月毕业于江南大学，获发酵工程专业工学博士学位。自2014年2月开始进入南阳师范学院工作，期间于2016年3月至2018年8月在华东理工大学许建和教授课题组进行博士后研究工作，主要从事于功能性食品添加剂及药物中间体的绿色生物合成相关的研究。近5 年，以第一作者或通信发表SCI论文20 篇，其中TOP期刊论文5 篇，授权发明专利3 项，获厅级科技成果一等奖3 项，主持国家自然科学基金项目、河南省青年科学家项目、河南省高校科技创新人才项目、河南省青年人才托举工程项目和河南省科技攻关项目等省部级以上项目5 项，完成成果转化2 项。多次获南阳师范学院最美教师、南阳师范学院优秀硕士生导师、南阳师范学院优秀共产党员等荣誉称号。

第一作者：

王瑶，女，2000年11月出生，南阳市唐河人，南阳师范学院2022级生物与医药专业硕士研究生，目前的主要研究方向为：基于理性设计提高酿酒酵母烟酰胺核糖激酶热稳定性及烟酰胺单核苷酸的合成。目前以第一作者发表1 篇EI文章。以第二作者发表SCI二区文章1 篇，EI文章2 篇。

本文《基于理性设计提高酿酒酵母烟酰胺核糖激酶1热稳定性》来源于《食品科学》2024年45卷24期92-99页。作者：王瑶，沈太松，李思晨，史红玲，姚伦广，唐存多。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240504-003。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：陈丽先；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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