《食品科学》：广东省农业科学院王旭研究员、赵洁副研究员等：基于非靶向代谢组学的六垌茶关键特征成分分析

六垌茶属白毛茶品种（

C. sinensis

pubilimba

传统六垌茶由较粗老的茶叶经萎凋、揉捻、摊晾、烘干等工序制作而成，外形条索粗壮。近年来，随着红茶的广泛传播和品牌价值提升，六垌茶也逐渐采用红茶工艺加工。加工后的六垌红茶外形条索紧秀，饮用方式为冲泡方式，其感官品质与传统六垌茶有鲜明差异。

茶一般而言，品种是影响茶叶品质的最重要因素。此外，茶叶的加工方式、采摘时间、种植模式、土壤肥力和气候条件等也决定了茶叶的品质特征和化学成分组成。代谢组学是了解茶叶代谢产物组成与茶叶各种环境和栽培条件之间关系的最佳方法，其中非靶向代谢组学有助于识别特征成分并为复杂的代谢组学提供全面的见解。

广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所的赵洁、李富荣、王旭*等采用非靶向代谢组学分析方法对不同加工工艺（传统、红茶）、采摘时间和种植模式下六垌茶的化学成分进行系统分析，识别不同六垌茶的关键特征成分，探究六垌茶关键特征成分在不同因素影响下的变化规律，探索不同六垌茶特征品质形成的机理机制，以期为六垌茶的品质评价、加工工艺提升和栽培种植等提供科学依据。

1 六垌茶的PCA和OPLS-DA

根据六垌茶的PCA结果可知，不同模型的QC样本均相对聚集（图1a～c），表明本实验获得的代谢组学数据变异性很小，实验期间该仪器精密度良好，数据具有较强的重现性和稳定性。不同加工工艺的六垌茶样品区分效果明显，TR和BT样品分别分布于QC样品的两侧，但不同采摘时间和种植模式下的样品区分效果不明显。PCA结果表明，与采摘时间和种植模式相比，加工工艺是影响六垌茶化学成分的重要因素。为了获得更高的分离水平，使用经典的监督判别模型OPLS-DA进行分析。结果表明，不同加工工艺、采摘时间和种植模式的六垌茶区分效果均非常明显，且同组样品更为聚集（图1d～f）。OPLS-DA模型的 Q 2 值描述了模型的预测能力，3 个模型的 Q 2 值为0.849～0.974（ Q 2 ＞0.5表明模型预测能力较好），3 个模型 Q 2 值大小排序为加工工艺＞种植模式＞采摘时间，且加工工艺和种植模式均大于0.9。不同模型均通过了置换检验（图1g～i）， Q 2 回归线与纵轴的交点均位于零点下方（ Q 2 ＜0.05表明预测能力良好），所有 Q 2 值均低于原始值，说明不同数据矩阵构建的OPLS-DA模型均没有出现过拟合现象，模型较可靠。由此可见，不同六垌茶之间的化学成分均存在较大差异，OPLS-DA模型可用于区分不同加工工艺、采摘时间和种植模式的六垌茶。

2六垌茶的关键特征成分识别与鉴定

采用Compound Discoverer 3.3软件内置的数据统计功能和OPLS-DA模型分析获得代谢物VIP值将|log 2 FC|＞2、 P adj ＜0.01且VIP＞1作为条件筛选六垌茶的特征成分。结合Compound Discoverer 3.3软件内置的mzVault和mzCloud数据库提供的一级质谱图和二级质谱图信息与实际样品进行比对，同时采用标准品对潜在的特征成分进行定性鉴定，包括保留时间、一级质谱和二级质谱等信息比对。由于茶树中的差异代谢物数量繁多，本研究重点关注在OPLS-DA模型中发挥重要分类作用的前8 个特征成分进行分析（即VIP值排名前8的化合物作为不同六垌茶的关键特征成分）。如表1所示，六垌茶的关键特征成分共23 个，其中(+)-没食子儿茶素同时为不同加工工艺和种植模式六垌茶的关键特征成分。23 个关键特征成分中，阿库米尼苷由质谱数据库确认，(+)-没食子儿茶素等22 个化合物同时由质谱数据库和标准品比对确认。其中12 个化合物通过标准品比对后确认为注释化合物；10 个化合物一级质谱和二级质谱比对后其保留时间不一致，故被确认为注释化合物的同分异构体。

由表1可见，区分不同六垌茶的关键特征成分主要为儿茶素及其衍生物（9 个）和黄酮类化合物（10 个），其总数占所有特征成分总数量的82.6%，区分不同种植模式的特征成分为(+)-儿茶素，其VIP值最大，为1.87。此外，关键特征成分中还包括2 个萜烯类及其衍生物（T）和2 个酚酸类化合物（P），值得注意的是，2 个萜烯类及其衍生物化合物（阿库米尼苷和桧烯的同分异构体）分别为区分不同加工工艺和采摘时间六垌茶具有最大VIP值的特征成分，其VIP值分别为2.32和2.42。不同加工工艺的其他关键特征成分VIP值为2.12～2.28，不同采摘时间的VIP值为1.81～2.12，不同种植模式的关键特征成分VIP值相对较小，为1.28～1.70。

3六垌茶的关键特征成分含量变化

如图2所示，不同加工工艺六垌茶的8 个关键特征成分中有4 个均为儿茶素及其衍生物（C）。其中，茶黄素-3-没食子酸酯在BT组中的含量高度显著高于TR（P＜0.001），而(+)-没食子儿茶素等3 个儿茶素及其衍生物（C）的含量均在TR组中更高（P＜0.001）。阿库米尼苷是一种萜烯类糖苷，也是区分不同加工工艺六垌茶中具有最大VIP值的特征成分，其在TR组中的含量高度显著高于BT组（P＜0.001）。其他关键特征成分如异荭草素等2 个黄酮类化合物和新绿原酸均在TR组中的含量更高，与BT组存在高度显著差异（P＜0.001）。可见，不同加工工艺主要影响六垌茶中萜烯、儿茶素、黄酮和酚酸类化合物的含量分布。

由表1、图3可知，8 个采摘时间关键特征成分中有6 个均为黄酮类化合物（F）。其中，具有最大VIP值的是桧烯的同分异构体，也是一种萜烯类及其衍生物，其在春茶（BQM、AQM组）中的含量高度显著高于夏茶（SU组）（

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不同种植方式的关键特征成分包括5 个儿茶素及其衍生物（C）、2 个黄酮类化合物（F）和1 个酚酸类化合物（P），其中VIP值较大的前2 个关键特征成分均为儿茶素及其衍生物，分别为(+)-儿茶素和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯。如图4所示，5 个儿茶素及其衍生物在WT组中的含量均高度显著高于AT组（P＜0.001），紫云英苷等2 个黄酮类化合物特征成分含量均在AT组中更高（P＜0.001）。结果表明，不同种植方式主要影响儿茶素及其衍生物的分布，WT组中的(+)-儿茶素等儿茶素及其衍生物含量高于AT组，但紫云英苷等黄酮类特征成分在AT组中的含量更高。

4六垌茶关键特征成分的分布特征

聚类热图可用于直观展示不同加工工艺、采摘时间和种植模式对六垌茶特征成分的影响。如图5所示，将不同分组的六垌茶进行聚类分析，结果表明TR和SU组聚集为一类，其他5 组的六垌茶聚为一类，可见TR与SU组的特征成分分布较为相似，其他5 组分布特征较为一致。其中，特征成分在TR与BT的分布特征存在较大差异，阿库米尼苷、新绿原酸和(-)-表儿茶素等7 个儿茶素类化合物以及异荭草素等9 个黄酮类化合物均在TR组中的相对丰度更高，而BT组中仅茶黄素-3-没食子酸酯等4 个特征成分的相对丰度更高。特征成分在AQM和BQM组的分布特征均较为一致，但在SU组中的分布特征不同，主要是异荭草素等8 个黄酮类化合物和(-)-表儿茶素7 个儿茶素类化合物均在SU组中相对丰度更高。此外，聚类分析结果显示AT与WT组存在较大差异，主要是AT组中阿库米尼苷、新绿原酸和(-)-表儿茶素等7 个儿茶素类化合物的相对丰度更低，这与箱线图结果基本一致。

非靶向代谢组学能覆盖广泛的代谢物并对其整体变化进行分析，从而实现不同样品间代谢物比对后获得潜在的特征成分。本研究基于非靶向代谢组学方法获得不同六垌茶代谢成分组成和含量信息，共提取到11 350 个代谢特征峰。基于Compound Discoverer 3.3软件中的mzVault和mzCloud数据库共鉴定了1 271 个化合物，主要分为儿茶素类、氨基酸类、黄酮类、生物碱类、酚酸类和萜烯类及其衍生物。采用化学计量学分析、数据库比对和标准品验证，最终鉴定出六垌茶的23 个关键特征成分，主要包括儿茶素及其衍生物、黄酮类化合物和萜烯类及其衍生物，并分析了这些关键特征成分在不同因素影响下的变化规律和分布特征。结果表明，不同加工工艺、采摘时间和种植模式的六垌茶化学成分存在差异，这与前人的研究结果 一致，加工工艺的差异导致不同的代谢轮廓产生，环境条件对基因型分布和代谢物分布也有很大影响。

儿茶素组分是茶树次生代谢产物的重要成分，对茶叶色、香、味品质的形成有重要作用。本研究发现多个儿茶素及其衍生物为不同加工工艺和种植模式六垌茶的关键特征成分，表明儿茶素类组分受加工工艺和种植模式因素的影响较大。其中红茶工艺促进茶黄素-3-没食子酸酯生成，(+)-没食子儿茶素和(-)-表儿茶素等简单儿茶素类化合物则在传统六垌茶中含量更高。这是由于红茶加工过程中儿茶素在多酚氧化酶的作用下氧化形成茶黄素-3-没食子酸酯等茶黄素。研究表明，茶黄素与红茶的浓郁口感和鲜亮的颜色有关，对红茶的色香味及品质起决定性作用。综上，红茶工艺可改变六垌茶的特征成分组成，形成新的六垌茶特征品质，而传统六垌茶则保留了更多的简单儿茶素组分。野生茶中(+)-儿茶素等儿茶素及其衍生物含量高于人工种植茶，可能是由于人工种植茶的土壤环境中水分和肥料更充足，而施肥降低了儿茶素的含量。有研究表明，与不施肥相比，经不同施肥处理3 a茶树的茶叶中没食子酸、酯型儿茶素、非酯型儿茶素及总儿茶素等含量降低。对有机茶和传统种植茶进行分析也发现，有机茶含有大量的(+)-儿茶素和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯等茶多酚，减半施肥量处理下茶叶的酯型儿茶素、非酯型儿茶素、总儿茶素与茶多酚均高于常规施肥方式，表明施肥不利于儿茶素类化合物的稳定。因此，人工种植模式下如何通过施肥管理等栽培技术提高六垌茶的品质还需进一步探究。

黄酮及其糖苷类成分不仅是茶汤汤色的重要组成部分，对茶汤的滋味也有重要贡献，其主要在叶片中存在，在茶嫩梢中含量较低。前人对采摘季节影响茶树代谢产物和茶叶品质的研究中发现，几种黄酮类化合物和氨基酸是导致茶叶感官品质季节变化的主要原因，黄酮类化合物在夏季茶叶中的含量显著升高。这与本研究中山柰酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷等黄酮类化合物在夏茶中显著升高的结果一致，这是由于在夏季高强度光照条件下茶树的碳代谢增强，黄酮生物合成结构基因的表达水平和一些重要酶的活性增加，从而导致黄酮类化合物含量增加。此外，本研究发现谷雨节气前后采摘的传统六垌茶与夏季采摘的六垌红茶特征品质较为相似，主要是对茶汤颜色和滋味具有重要贡献的黄酮及其糖苷类成分的相对含量较高，可见茶叶原料的粗老程度对六垌茶的特征品质形成具有重要影响。随着广西瑶族地区的油茶文化和油茶饮用方式的推广，将夏季茶叶以传统工艺加工成油茶，可能是未来六垌茶产业提质增效的重要思路之一。

萜烯类化合物是茶叶香气的重要来源，其在茶树芽叶中主要以糖苷形式存。本研究获得的23 个特征成分中，受加工工艺和采摘时间因素影响具有最大VIP值的特征成分均为萜烯类及其衍生物，且在传统六垌茶中的含量高度显著高于红茶，春茶高于夏茶。研究表明，糖苷的降解在红茶香气形成过程中起到了最重要的作用，这是由于加工过程中的酶促反应，糖苷类化合物在糖苷类酶的作用下水解释放出挥发性香气组分。与红茶工艺相比，传统的六垌茶加工工序较少，发酵程度较低，因而阿库米尼苷等萜烯类糖苷在传统六垌茶中得以更大程度保留，其含量更高。还有研究表明，适制乌龙茶品种糖苷类香气前体含量较高，因此在高香型茶树品种选育过程中宜筛选高糖苷含量的茶树种质资源。鉴于此，下一步值得继续探索六垌茶的乌龙茶适制性加工工艺，充分挖掘六垌茶的品种资源。除了受加工因素的影响，采摘季节对茶叶香气的形成同样起重要的作用。研究表明，当茶树处于逆境胁迫时，叶片内的萜烯糖苷动态平衡遭到破坏，萜烯类物质大量合成。因此，不同季节采收的茶树叶片中酶和化学物质的差异导致形成不同的茶叶香气成分和含量，而本研究中春茶与夏茶的最主要差异特征成分为萜烯类化合物。

值得一提的是，虽然非靶向代谢组学可以对茶叶中的大多数代谢物进行分析，但是茶叶提取物中存在许多同分异构体。本研究使用的高分辨率质谱能够提供足够的质量精度用于化学式生成，但在允许误差范围内（5×10 -6 ）存在许多可能的分子式，以及每个分子式在自然界中可能都存在多个同分异构体，而具有相同元素组成和相似结构的同分异构体分子会导致代谢物的鉴定和定量极其困难 。本研究中获得的两个萜烯类化合物特征成分均未通过标准品验证，主要是由于虽然茶叶中已分离鉴定的萜烯类有近百种，但其种类数量繁多、结构复杂，且大部分香气物质来源于工业和有机化学合成等已报道的成分，茶叶中许多特有化学成分的分离纯化和结构鉴定尚待深入研究 。

结论

采用非靶向代谢组学和化学计量学分析方法可获得不同加工工艺、采摘时间和种植模式茶叶的主要代谢物信息，建立可用于区分不同六垌茶的OPLS-DA模型，以|log 2 FC|＞2、

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作者简介

第一作者：

赵洁，女，中共党员，博士，主要从事农产品营养特征品质鉴别、农产品质评价等工作。是广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所品质研究室骨干，全国名特优新农产品评价鉴定专家、全国名特优新农产品全程质量控制技术广州中心副秘书长，广东省农村科技特派员。主持或主要参与国家重大研发专项、农业农村部农产品质量安全监管专项、各类横向项目等40余项；发表学术论文24 篇，其中第一作者8 篇；获得广东省科学技术奖励三等奖、广东省农业技术推广奖一等奖、广东省农业科学院科技技术一等奖、梅州市科技三等奖等共7 项；制修订农业行业标准7 项，团体标准2 项，获发明专利3 项；参编《农产品质量安全学概论》等著作2 部。

本文 《基于非靶向代谢组学的六垌茶关键特征成分分析》来源于《食品科学》2024年45卷第22期154-163页，作者：赵洁 ，李富荣 ，刘雯雯 ，马姜明 ，秦佳双 ，陈岩 ，王旭。DOI:10.7506 / spkx1002-6630-20240227-144。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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