氨基甲酸乙酯（EC），是传统发酵食品（如食醋、酱油、泡菜、白酒、葡萄酒、黄酒等）在发酵或酿造及储存过程中形成的2A类致癌物质。由于EC分子结构稳定，形成后难以分解，因此从末端直接消除所有途径中形成EC的直接消减法，理论上是控制传统发酵食品中EC含量的最佳方法之一。目前尚无可高效降解发酵食品中EC的酶，原因是所发现的酶生化特性存在重大缺陷。因此，筛选表征出具有优良性能的、可降解EC的酯酶，可有效解决酶在应用中存在的尿素与EC竞争的难题。

安徽工程大学生物与食品工程学院的刘庆涛、朱司宝、田淑芳*等以文献报道的可降解EC的酯酶氨基酸序列为依据，在NCBI数据库中挖掘出9 个可能具有EC水解作用的酯酶；通过全基因合成及重组大肠杆菌异源表达技术，对9 个酯酶进行异源表达，并对重组酯酶进行EC水解能力鉴定；在此基础上，对具有高EC水解活力的4 个酯酶进行纯化及酶学性质测定。本研究丰富了EC水解酶酶库，同时为酶法降解传统发酵食品中致癌物EC提供了新方法。

1 酯酶挖掘与序列分析

来自于醋酸钙不动杆菌A. calcoaceticus（GenBank No. BAC55927.1）的酯酶具有EC水解酶活力，且其降解EC为无毒的氨、乙醇及CO2。本研究以该酯酶氨基酸序列为模板，进行BLASTp搜索，对获得的蛋白序列构建系统进化树（图1）。选择与模板序列相似度在80%以上的9 个蛋白ES1～ES9，进行氨基酸比对分析。来自于不动杆菌Acinetobacter sp. NBRC 110496（WP_043970715.1）的ES9与模板酯酶氨基酸序列相似度为81.2%。目前结构得到解析的酯酶中，来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida IFO12996的酯酶（PDB NO. 1ZOI）与ES9具有最高的氨基酸相似度（70%），通过COACH对ES9蛋白EC结合位点进行预测，结果显示，结合位点大约位于蛋白分子的中间，距底物通道入口12 Å，由7 个氨基酸残基（Trp31、Leu33、Thr98、Val124、Phe166、Phe203、Val229）组成（图2）。序列比对结果显示，9 个酯酶都含有“Ser97-Asp227-His256”催化三联体及α/β水解酶超家族大多数成员具有的保守区序列G-H-S97-T-G（图2）。选取1～9号代表性的酯酶为研究对象，进行下一步的实验分析。

2 重组酯酶的表达、EC降解能力鉴定及纯化

9 株重组大肠杆菌经诱导发酵及超声破碎后，进行酶活力测定和重组蛋白表达分析。酶活力测定结果表明（图3），除ES6及ES7仅有极其微弱活力外，其余7 个酯酶对EC均具有水解作用，且ES1、ES5、ES8和ES9在pH 4.5及pH 7.0条件下有相对较高的酶活力；以尿素为底物进行酶活力测定发现，9 种酯酶均未显示酶活力，结果表明酯酶对尿素无水解作用。SDS-PAGE分析结果显示（图4A、B），与不含酯酶的重组大肠杆菌相比，9 种重组大肠杆菌的细胞裂解液上清和沉淀样品都在30 kDa附近均出现了条带，与重组酯酶分子质量理论值（ES1～ES9：30.95、30.99、30.96、30.96、30.98、30.90、31.01、31.06、30.97 kDa）基本相符，由此说明ES1～ES9全部在 E. coli BL21（DE3）细胞内实现了可溶性表达，但ES4表达量较少（图4A、B）。因此，选定ES1、ES5、ES8和ES9进行进一步的Ni-NTA亲和层析纯化，结果如图4C所示，蛋白胶上显示为单一条带，因此4 种酯酶均得到了良好的纯化。

3 重组酯酶的酶学性质分析

3.1 最适反应温度和温度稳定性

如图5所示，ES1和ES5的活力从20～70 ℃一直在增加，在70 ℃时达到峰值，因此它们的最适温度均为70 ℃，远远高于来源于根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens d3（55 ℃）的酰胺酶和副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis（50 ℃）的双功能脲酶；在反应温度高于70 ℃后，酶的蛋白结构可能被破坏导致酶活力大幅度降低；ES8与ES9最适温度均为55 ℃，高于来源于米曲霉Aspergillus oryzae的酰胺酶（40 ℃）；其中ES8随着温度的升高，酶活性丧失较慢，在70 ℃时酶活力降低至50%左右，而ES9在温度仅升高5 ℃的情况下，酶活力降低至50%左右；重组酶ES1与ES5在50～70 ℃范围内相对酶活力在50%以上，而重组酶ES8在45～70 ℃范围内，ES9在45～60 ℃范围内相对酶活力在50%以上。

4 种酯酶分别在不同温度下孵育1 h后在最适反应温度及pH 4.5条件下检测其残余酶活力，结果显示（图6），4 种酯酶均在温度低于40 ℃时较稳定，经处理后其酶活力均可保持90%以上，当温度高于45 ℃后酶活力下降明显，表明4 种酯酶在温度高于45 ℃后空间结构受到较大程度影响。4 种酯酶在65 ℃保温1 h，酶活力仍残余约50%，表现出比可降解EC的酰胺酶及脲酶更好的热稳定性。

3.2 最适反应pH值和pH值稳定性

如图7所示，在pH 3.0～7.0条件下，随着pH值的升高，酶活力逐渐提升，ES8在pH 7.0条件下的酶活力最高，为中性酶；而ES1、ES5与ES9均为碱性酶，随着pH值上升到8.0的过程中，其活力也一直处于上升状态。当pH 6.0～8.0时，4 种酯酶活力均可以保持80%以上，表明在接近中性的条件下可以较好地释放酶活力；当pH值大于8.0时，由于更换缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0～9.0和20 mmol/L Gly-NaOH缓冲液，pH 9.0～10.0），4 种酯酶以EC为底物时的酶活力均无法测定出，推测更换的缓冲液会影响测定酶活力时的显色反应。在pH 4.5条件下ES1、ES5、ES8与ES9相对酶活力分别为79.19%、64.22%、69.96%、50.99%，4 种酯酶均具有超过50%的相对酶活力，相较于酰胺类EC水解酶，本研究挖掘出的酯酶可以在pH 4～5条件下发挥活性。

将酯酶在不同pH值条件下4 ℃保温6 h后测定酶活力，结果如图8所示，当酯酶在pH值为7.0～8.0时，4 种酯酶的残余酶活力均保持在90%以上，当pH值小于7或大于8时，残余酶活力明显下降；ES1、ES5、ES8与ES9经pH 4条件下处理后，可分别保持68.65%、42.68%、43.80%、19.87%的酶活力；相较于酰胺类EC水解酶及来源于解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens JP-21的中性脲酶，ES1表现出更好的酸稳定性。以上结果表明，所获得的4 个重组酯酶在pH 6.0～8.0内具有较好的反应活性以及稳定性，适用于弱酸、中性及弱碱等发酵食品中EC降解方面的应用。

3.3 乙醇与氯化钠耐受性

如图9所示，当乙醇体积分数为10%时，ES1、ES5、ES8与ES9的相对酶活力分别为50.48%、48.44%、42.60%、33.59%，当乙醇体积分数为20%时，其相对酶活力分别为40.98%、36.03%、27.97%、22.72%，表明4 种酯酶均具有一定的乙醇耐受性。与来源于赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SCO2的突变体（21.03 %）相比，在20%的乙醇环境下ES1相对酶活力（40.98%）约是其2 倍，表现出一定的乙醇耐受性，而ES9在含乙醇的环境下酶活性降低较快，结合之前其温度及pH值稳定性结果，推测ES9对环境耐受性较低，结构较不稳定。

由图10可知，当氯化钠质量分数为5%时，ES1、ES5、ES8与ES9的相对酶活力分别为24.09%、20.41%、16.11%、10.73%，当氯化钠质量分数高于5%时，4 种酯酶对EC基本失去催化活力，表明4 种酯酶耐盐性均较差，不具有应用于高盐发酵食品中EC降解的潜力。

3.4 金属离子和化学试剂对酶活力的影响

如图11所示，所检测的大多数金属离子对酯酶活力均有一定的抑制作用。经Cu 2+ 处理后，ES1、ES5、ES8及ES9的相对酶活力分别为12.11%、2.31%、34.69%、37.07%，说明Cu 2+ 对ES5的抑制效应相比ES1、ES8及ES9较强。经Fe 3+ 处理后，ES1、ES5、ES8及ES9的相对酶活力分别为5.81%、5.15%、1.78%、9.98%。经Co 2+ 处理后，ES1、ES5、ES8及ES9的相对酶活力分别为4.79%、7.57%、3.46%、3.39%，结果表明Cu 2+ 、Fe 3+ 、Co 2+ 均可显著抑制4 种酯酶的活性，而Zn 2+ 对ES1有小幅度的激活作用，可激活26.49%的酶活力，推测Zn 2+ 和酯酶ES1结合后可能会形成更稳定的复合物。

在EDTA存在的情况下，酶活力依然在90%以上，证明4 种酯酶为非金属依赖型酶或金属离子包埋在酯酶深处无法被螯合出。当表面活性剂Triton X-100存在时，ES1、ES5、ES8及ES9分别可保持91.03%、111.92%、67.86%、84.35%的酶活力，表明活性剂Triton X-100对ES5有小幅度激活作用，对ES1及ES9影响不大，对ES8活力有一定的抑制作用。

4 重组酯酶的动力学参数

鉴于大多发酵食品（如黄酒、酱油等）均偏酸性（pH＜5.0），因此本研究检测4 种酯酶在酸性（pH 4.5）条件下的动力学参数。以EC为底物，在pH 4.5条件下测定重组酶在10～1 000 mmol/L EC浓度下的初始反应速率，然后由Graph Pad将初始反应速率与对应的底物浓度拟合计算，得到ES1、ES5、ES8和ES9的酶促反应参数。结果表明（表1），ES1、ES5、ES8和ES9的K m 值分别为（210.7±9.3）、（213.8±8.92）、（256.2±11.02）、（127.2±6.53）mmol/L；V max 值分别为（87.54±4.19）、（84.14±4.96）、（79.91±3.64）μmol/（min·mg）和（63.44±2.96）μmol/（min·mg）；k cat /K m 值分别为（214.31±23.24）、（203.20±21.47）、（161.46±17.43）L/（mol·s）及（257.43±23.89）L/（mol·s）。酰胺类EC水解酶在pH＜5.0条件下无催化活性，它们在最适pH值条件下对EC的K m 为0.87～37.2 mmol/L。来源于B. paralicheniformis的双功能酸性脲酶在pH 4.5条件下对EC的K m 及k cat /K m 值分别为1 018 mmol/L及440 L/（mol·s），因此与该酸性脲酶相比，本研究中重组酯酶具有较高的EC亲和力，但重组酯酶催化效率k cat /K m 值与酸性脲酶相比较低。文献[26]未报道来自于A. calcoaceticus的模板酯酶在酸性（pH 4.5）条件下的动力学参数值。

以上结果表明通过基因挖掘得到的酯酶对酸性条件（pH 4.5）下对EC具有较弱的亲和力及催化效率，但从对尿素的非降解的底物特异性和一定程度的乙醇耐受性来看，酯酶作为一种新的EC水解酶仍具有良好的应用前景。因此后续可对重组酯酶进行定向改造以提高其在酸性条件下对EC的亲和力和催化效率。

5 酯酶以EC为底物时动力学参数存在差异的潜在机制

底物通道形状与大小、活性口袋氨基酸的疏水性与净电荷等效应均对酶的底物特异性、最大反应速率等产生一定的影响。将酯酶氨基酸序列分别提交至trRosetta网站进行蛋白质结构建模得到4 种酯酶的蛋白三维结构（图12A～D），用PyMol对获得的酯酶进行结构分析，发现以ES1为模板进行比对时，ES5、ES8和ES9的RMSD值分别为0.26、0.45 Å和0.49 Å，均小于0.5 Å，表明4 种酯酶在高级结构中表现出高的相似性。底物通道入口分析显示，ES1与ES5的入口处被氨基酸残基分隔成两部分；ES8通道入口处形状不规则；ES9的通道入口较为规整，呈椭圆形，没有氨基酸残基凸起阻碍底物进出，因而可能更有利于底物的结合与释放。然而经过对底物通道最宽距离的测量发现，ES9的底物通道相较于另外3 种酯酶最宽的直径缩短了1.3～5.1 Å；对底物通道最窄距离测量结果显示（ES1及ES5取底物通道占比最大口袋测量结果），ES9的底物通道相较于另外3 种酯酶最窄的直径缩短了2.2～3.4 Å。EC的三维分子结构尺寸分别为8.74、6.07 Å与4.62 Å（图12E），ES9的底物通道入口最宽与最窄距离分别为6.9 Å及5.2 Å（图12D），因此EC只能沿着特定取向进入ES9活性口袋，而对于其他3 个酶来说，EC可能沿着更多不同的取向进入活性口袋，由此可能影响了ES9对EC的最大反应速率。

对形成酯酶活性口袋的氨基酸残基计算净电荷与亲水指数。4 种酯酶活性口袋内的净电荷相同，均为3.204×10 -19 C。酯酶ES1、ES5、ES8和ES9活性口袋氨基酸的亲水指数分别为30.3、30.9、30.4、25.1，亲水指数越大疏水性越强，所以ES9催化环境亲水性强于其他3 种酯酶。在水解酶的催化水解反应中，亲水性氨基酸残基有利于与底物形成更多的氢键相互作用，从而固定底物在催化反应中的空间位置、促进酶对底物的催化作用。使用DS软件对酯酶ES8及ES9分别与底物EC进行分子对接，用PyMOL软件分析酯酶与EC复合物结构。结果显示（图12F、G），酯酶ES8与S97之间形成1 对氢键，而ES9分别与S97及H256均形成1 对氢键，较强的氢键相互作用可能使得ES9更易与EC进行结合，致使ES9对EC的亲和力较高。

6 结 论

酯酶可降解EC生成无毒的氨、乙醇及CO 2 ，其不降解尿素的特性，可有效解决酰胺类EC水解酶及脲酶在降解发酵食品中EC时所存在的高浓度尿素干扰酶对EC降解的问题。本研究从NCBI数据库中挖掘到4 种具有EC降解作用的酯酶（ES1、ES5、ES8和ES9），并实现了它们在重组大肠杆菌BL21（DE3）中的异源表达、纯化及酶学性质研究。4 种酯酶最适pH值为7.0，在pH 4.0～5.0条件下均有活力；其中在pH 4.0条件下ES1的稳定性最强，在此条件下4 ℃放置6 h后可保持68.65%的残余酶活力。4 种酯酶对低体积分数的乙醇具有一定的耐受性，ES1对乙醇耐受性最强，它在乙醇体积分数10%时，可保持50.48%左右的相对酶活力，因此具有应用于低酒精度酒精饮料中EC降解的潜力。4 种酯酶不具有高盐耐受性，当氯化钠质量浓度高于5%时，酯酶基本失去活力。4 种酯酶在pH 4.5条件下对EC的亲和力（K m ＞100 mmol/L）及催化效率（k cat /K m ＜300 L/（mol·s））均较低，不利于它们对酸性环境中低含量EC的降解。未来可通过蛋白质工程技术，对酯酶进行定向改造，获得在酸性条件下EC亲和力及催化效率提高的酯酶，以促进其在实际反应体系中的应用。对酯酶进行结构分析推测，ES9相对较小的底物通道可能影响了EC的进入，从而影响了ES9对EC的最大反应速率；而ES9高的EC亲和力可能归因于ES9与EC之间强的氢键作用力。本研究获得了具有一定的乙醇耐受性、酸耐受性且EC降解活性的酯酶，不仅丰富了EC水解酶酶库，也为未来控制低酒精度酒精饮料中EC含量提供了新方法。

通信作者

田淑芳，安徽工程大学生物与食品工程学院 讲师。 主要从事 系统生物学的微生物群落分析及功能菌株的筛选 ，包括 传统发酵食品中有害物质的调控、 功能性产物的生物合成等。 主持国家自然科学基金青年基金 、国家级大学生创新创业训练计划 等 项目。 近 5 年，来以第一作者 身份 在《Food Research International》《Food Control》《Bioresource Technology》等 国际 期刊发表SCI论文6 篇；授权发明专利 3 件 。

第一作者

刘庆涛，安徽工程大学生物与食品工程学院 讲师/硕士生导师。 主要从事工业微生物发酵与酶工程领域研究工作，研究方向为传统发酵食品中有害物的酶法消除、工业酶的挖掘与高端定制化。近年来，主持国家自然科学基金青年项目、安徽省自然科学基金青年项目、安徽省高校自然科学基金重点项目等3 项；在《Applied and Environmental Microbiology》《Journal of Agricultural and Food Chemistry》《ACS Synthetic Biology》等期刊发表 SCI 论文1 0 余篇，授权国家发明专利8 项。

本文《降解氨基甲酸乙酯的酯酶挖掘及酶学性质表征》来源于《食品科学》2025年46卷第2期99-107，作者：刘庆涛，朱司宝，王天文，李闯，钱森和，张温清，程凡，田淑芳。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240603-011。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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