撰文 | 一只鱼
泛素化修饰通过精确调控蛋白质水平、活性和定位来响应生理刺激，人类基因组编码约650种E3连接酶，且具有高度特异性。E1泛素激活酶和去泛素化酶具有封闭的活性口袋，而E2泛素结合酶和E3连接酶的活性位点突出于蛋白表面，这种缺乏活性口袋的特性既限制了小分子结合，也阻碍了抑制剂对其的识别。E6AP C端同源结构域（HECT）类E3连接酶与人类疾病直接相关，但目前尚无HECT的选择性抑制剂获批。
近日，来自英国谢菲尔德大学的David J. Rowlands研究团队在Cell上发表题为Therapeutic potential of allosteric HECT E3 ligase inhibition的文章，通过大规模无偏好性生化筛选发现了HECT家族成员SMURF1的抑制剂，可通过延伸α螺旋跨越保守甘氨酸铰链来限制其关键催化运动，并对肺动脉高血压的疾病模型具有良好的疗效。将这一机制应用于基于机器学习计算的筛选，他们还成功鉴定出HECT原型E6AP的抑制剂，开辟了新的药物开发空间。
HECT家族成员SMURF1在癌症、骨骼、肺部及中枢神经系统疾病中具有重要作用，SMURF1是骨形态发生蛋白（BMP）信号通路的负调控因子，参与调节细胞迁移、增殖和凋亡。为了筛选SMURF1的抑制剂，研究人员开发了基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的SMURF1自泛素化检测方法，对110万种化合物进行了大规模无偏向性高通量筛选，鉴定出三类具有良好类药性质的化合物：哌啶磺酰胺类、吡唑酮类和吡咯类。SMURF1由含甘氨酸的柔性铰链连接N端和C端小叶，该铰链介导的N-C端小叶运动对泛素从E2经HECT C端小叶转移至靶蛋白至关重要。他们选择代表性抑制剂Cpd-8进行研究，通过结构分析发现其变构抑制机制，Cpd-8结合SMURF1的N端隐蔽空腔，导致α螺旋10（αH10）延长，铰链长度缩短，/二面角耐受性降低，构相改变。然后他们分别构建了限制/二面角和缩短铰链长度的SMURF1突变体，验证了甘氨酸铰链的柔性与长度对SMURF1功能的关键作用，并设计了两类抑制剂抵抗型突变体：铰链修复型（637GGLDINS）：在αH10下游插入GGLD序列，恢复铰链柔性与长度；变构抵抗型（SMURF2lation）：将αH10 C端两个关键残基替换为SMURF2同源位点（SMURF2对抑制剂不敏感），这两类突变体都可以显著抵抗Cpd-8的抑制效果，进一步分析证明抑制剂通过诱导αH10跨越保守甘氨酸铰链延伸，形成稳定非共价键网络，从而缩短铰链长度并降低其柔性，最终抑制SMURF1催化功能。
BMP信号传导减弱是肺动脉高血压（PAH）的发病诱因，而SMURF1是BMP信号通路的负调控因子，他们发现在PAH患者中，SMURF1高表达。进一步分析发现SMURF1可以直接泛素化BMP信号通路中的关键因子SMAD1和BMPR2，抑制SMURF1可以促进BMP信号传导，重建肺部血管稳态，并且在已发病PAH的大鼠模型中，抑制SMURF1可以逆转其病理状态。
最后由于SMURF1抑制剂特异性阻断了HECT结构域N端与C端小叶间保守的关键运动，他们猜测这种变构抑制机制可作为计算机模拟方法的基础，用于识别其他HECT E3连接酶的潜在抑制剂，为模拟潜在结合空腔，他们将HECT家族成员的氨基酸序列与处于抑制状态的SMURF1结构进行比对建模，随后采用基于机器学习的筛选方法对约800万个小分子进行初筛，选取评分最高的候选分子进行后续评估。为验证该方法的普适性，他们以HECT E3连接酶的原型E6AP为研究对象，筛选出化合物i-27可以通过变构机制选择性抑制E6AP活性。因此，通过计算筛选稳定重塑抑制结构的化合物，可发现具有相同变构机制的抑制剂，且这种基于隐蔽空腔重塑的策略可为发现其他变构抑制剂提供新思路。
HECT E3连接酶的变构抑制剂开发
总的来说，这项研究发现了HECT E3连接酶的变构抑制剂，并且这种基于隐蔽空腔重塑的策略为发现其他变构抑制剂提供了新的思路，为药物开发开辟了新的领域。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.03.001
制版人： 十一
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