拒稿反思：WB 得提交全膜数据，内参和目标蛋白不能拆|偶联|全膜|抗体|特异性|电泳|细胞|蛋白

小师妹

这稿件直接决定我是否按时毕业，可审稿人反馈说里面的 WB 数据可信度不足，这条带那么清晰，为什么被质疑真实性？

你的内参和目标蛋白的信号是不是没在同一张膜上？

大师兄

小师妹

分子量有差异，肯定要裁膜并分步孵育抗体，同一张膜上呈现信号，这不是为难我吗？

我们可以用杂志推荐的总蛋白归一化，全膜同时检测目的蛋白和总蛋白，无需染色就可以获取目的蛋白表达差异，还不用担心内参跑不齐。如果不做，可能会出现系统性偏差，导致生物学结论误判，审稿人自然会质疑结果的可靠性。

大师兄

随着期刊杂志对 WB 数据的要求越来越严格，提供带 marker 的全膜图像已逐渐变成数据提交的基本要求。大部分期刊如

Nature、Cell、JBC、J CELL BIOCHEM

等已经加强对 WB 实验数据的要求，涉及原始图片提交、泳道分割和 Marker 等等。但是由于抗体特异性和表达量差异，大多数情况下需要裁膜、洗膜分别获取内参和目的蛋白的信号， 总蛋白归一化就通过量化全泳道的蛋白总量来校准数据，能有效消除上样误差、转膜效率差异等干扰。本文将聚焦归一化策略，助你获取更可靠的 WB 数据！

为什么要做归一化计算？

WB 实验涵盖样本制备、上样电泳、转印封闭到孵育成像等环节，通常需 1~2 天才能获得可分析数据。实验人员的操作习惯与环境条件均可能对最终结果产生显著影响（如图1）。

图1. 不同实验人员使用同一样品进行 WB 实验定量分析

图 1 所示为三位实验人员使用同一样品获得的 WB 结果，Cy3（绿色）为目标蛋白，Cy5（红色）为总蛋白。在同一张膜上，直接使用 Cy3 目标蛋白信号计算，不同泳道间 CV 值 >6%。利用 Cy5 进行归一化后 CV 值由最大 9.8% 降低至 5%。结果表明实验中需依赖参比数据才能提高定量准确性。

总蛋白归一化的必要性

WB 实验中，传统内参常选用看家蛋白（如 GAPDH、β-Actin、Tubulin），其理想特性为不受实验及病理条件影响的内源性稳定表达。但大量文献证实，在组织差异、细胞应激、药物处理、疾病模型等多种实验条件下，这类蛋白的表达水平会显著波动。例如，缺氧、代谢紊乱等病理条件可诱导 β-actin 表达下调，细胞周期同步化处理会导致 GAPDH 表达不稳。

鉴于传统内参的局限性，基于泳道总蛋白信号进行参比计算的「总蛋白归一化」方法，逐渐获得科研领域认可，例如《