动物屠宰放血后阻断了肌肉组织与外部环境的联系，机体供氧中断会改变肌肉的能量代谢，进而使肌肉细胞中的线粒体电子传递链受到干扰，血流和氧气供应的减少会导致活性氧（ROS）含量增加 ， 当ROS水平超过抗氧化系统的还原能力时，肌细胞会发生氧化应激从而打破机体氧化还原系统的平衡。核酸脱甘糖酶DJ-1蛋白（也称PARK7）具有分子伴侣、蛋白酶、转录调节因子的特性 ，作为动物体内关键的抗氧化应激蛋白，可调控多种抗氧化应激分子的信号通路，在宰后成熟过程中通过增强细胞对ROS的清除能力，从而在调节氧化应激诱导的细胞凋亡中发挥关键作用 。
蛋白质是肌肉组织的主要成分，参与肌肉到食用肉代谢途径的调节。蛋白质组学可作为一种表征细胞或组织中全部蛋白质（蛋白质组）特征的研究工具，可以反映肌肉蛋白的变化情况，已逐渐被用于鉴定与肉质特征相关的蛋白质，而4D-非标定量（4D-LFQ）蛋白质组学较传统的蛋白检测具有更高的灵敏性，在肉品科学领域利用该技术可筛选并鉴定与肉品质变化相关的标记蛋白以及探究肉品质形成的分子机制，这对于提高牛肉品质及生产加工肉类具有重要意义。
宁夏大学食品科学与工程学院的张静、赵文秀、李亚蕾等选取宰后不同成熟期间的秦川牛背最长肌为研究对象，探究DJ-1表达量变化与肉品质及ROS变化的关系，结合4D-LFQ蛋白组学技术、基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析确定秦川牛背最长肌蛋白质DJ-1及相关差异蛋白参与调控肉品质的通路，以期从DJ-1表达量变化角度分析秦川牛宰后肌肉成熟机理，为宰后肉品质形成提供理论依据。
1 秦川牛宰后成熟过程中肉品质的变化
1.1 pH值的变化
pH值能反映肉品宰后成熟的进程，是衡量肉品质的关键指标之一，直接影响嫩度、持水性、风味等多项肉的食用品质。如图1所示，宰后初期0～4 d秦川牛的pH值显著降低（
P＜0.05），这可能是因为宰后肌肉进行无氧糖酵解产生乳酸，且肌酸和ATP的水解又会产生磷酸，最终导致pH值呈现出迅速下降的趋势。成熟4 d后pH值有缓慢回升的趋势，肌肉成熟到8 d时，pH值上升至5.80±0.02。这是由于肉样的pH值达到极限时，Ca 2+ 从肌质网释放从而激活钙蛋白酶，蛋白酶解会导致三甲胺、氨基酸分解产物等碱性物质的积累，使肉样pH值升高 。李婕等 在对热休克蛋白27与食用品质的关系研究中发现，耗牛背最长肌的pH值随成熟时间的延长呈现先下降后上升的趋势，本研究结果与其一致。
1.2 肉色的变化
肉的色泽是人们评价其食用品质最直观的指标，对判断鲜肉货架期有重要意义。肉色变化取决于脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白及高铁肌红蛋白3 种蛋白的绝对含量及其相互转化的比例。一般认为，肉的
L*值越低、
a*值越高、
b*值越低，肉色越好 。
a*值通常是反映肉色的重要指标，
L*值能够反映肉色的稳定性，由表1可知，宰后0～8 d内
L*和
a*值都呈先升高后降低的趋势（
P＜0.05），这是因为
L*值与肉品的表面水分含量有关 ，成熟前期牛肉的折射率随汁液的分泌会增大，成熟到4 d时
L*值达到最大（41.17±0.35）。由于肌肉排酸初始对氧气的消耗减少，利于氧合肌红蛋白的生成，另一方面线粒体呼吸作用产生的NADH增强了肌肉中还原酶的活力 ，因此
a*值增大。随着成熟时间的延长，牛肉中水分流失，光线散射也随之减弱，此时肉的色泽变暗，
L*值明显降低。
a*值下降是由于高铁肌红蛋白的累积，鲜红色的氧合肌红蛋白极不稳定，容易与空气中的氧气接触被氧化成暗褐色的高铁肌红蛋白。这一变化趋势与孙志昶 对宰后耗牛成熟对肉品质影响的研究结果相似。整个成熟过程中，秦川牛背最长肌的
b*值呈现持续上升的变化趋势（
P＜0.05），这可能是由于肌肉与氧气充分接触导致牛肉里的脂肪发生氧化，最终使
b*值增加 。
1.3 剪切力的变化
剪切力作为评定肉品嫩度的重要指标之一，其值越高表明肉品嫩度越差。动物被屠宰后经历尸僵、解僵和成熟的过程，剪切力也随之变化。如图2所示，剪切力呈现先上升后下降的变化趋势（
P＜0.05），宰后0～4 d，剪切力从（126.40±1.25）N升至（152.89±0.61）N，成熟4 d时的剪切力最大，说明此时肉嫩度最差，肌肉较为僵硬。在此之后剪切力逐渐降低，说明肉质越来越嫩，宰后成熟过程显著影响秦川牛剪切力，成熟时间的适度延长有利于肉品嫩度的改善。出现该现象的原因可能是在牛肉成熟初期，肌原纤维蛋白的磷酸化会抑制肌动球蛋白的解离进而影响肌纤维收缩 ，同时肌凝蛋白凝固和肌纤维的硬化也会导致肉嫩度变差，随着成熟时间的延长，肌肉进入解僵成熟阶段，在Ca 2+ 及激活酶对Z线的长时间作用下，肌原纤维断裂成不同数目肌节的小片段，剪切力降低，从而使牛肉的嫩度得到改善 。但过长时间的成熟会使肉的新鲜度下降。
1.4 滴水损失的变化
滴水损失是受重力影响且无其他外力作用下判断肌肉蛋白质保水性的一个关键参数，可模拟冷鲜肉在市场中自然悬挂状态下汁液流失的现象。由图3可知，秦川牛的滴水损失随成熟时间的延长呈先上升后下降的趋势（
P＜ 0.05）。宰后0 d时的滴水损失率为（1.71±0.15）%，4 d时达到最大值（5.67±0.19）%，8 d时为（2.33±0.17）%，这是由于肌肉在成熟前期的肌纤维束和单个肌肉细胞分离程度加剧，肌肉蛋白质网络空间缩小，细胞内水分不断渗出，导致肌肉持水能力下降 。秦川牛的肌肉解僵成熟过程中，肌原纤维间隙增大，自由水和不易流动水大量损失，细胞外水分渗入细胞内，导致滴水损失降低。牛克兰 以牦牛背最长肌为研究对象探究了冷鲜牦牛肉贮藏的损失情况，结果表明宰后成熟期间贮藏损失呈先上升后下降的趋势，本研究结果与其一致。
1.5 离心损失的变化
离心损失可反映秦川牛肉保水性的变化情况。由图4可知，秦川牛的离心损失在宰后成熟期间呈先上升后下降的趋势（
P＜0.05 ）。这是因为在离心力的作用下细胞中的部分不易流动水转化为自由水，宰后成熟前期（0～4 d）的pH值降低会导致维持细胞骨架的连接蛋白发生氧化降解，细胞结构被破坏导致汁液损失增加，离心损失率升高 ，由0 d时的（3.59±0.15）%上升到4 d时的（9.75±0.38）%。当pH值下降到肌肉蛋白质静电荷为零时，蛋白质对水的吸附能力减弱，肌原纤维的内部结构减小导致水分被大量挤出，此时肉品的保水性最差。
2 秦川牛宰后成熟过程中DJ-1与ROS的变化
2.1 蛋白质DJ-1表达量的变化
有研究表明DJ-1在肌肉组织中大量表达，包括牛的背最长肌、半腱肌 ，羊的半膜肌和内股肌 。由图5可知，宰后0～8 d蛋白质DJ-1表达量随着成熟时间的延长呈持续上升的显著趋势（
P＜0.05），宰后0 d的DJ-1表达量最低，为0.334±0.020，第8天表达量达到最大值，为1.169±0.030。这是由于秦川牛宰后初期肌细胞缺血缺氧的环境导致机体有氧代谢受到阻碍从而发生应激，具有保护功能的蛋白质会迅速做出反应，DJ-1立即合成，发挥强大的抗氧化应激作用以维持细胞稳态；随着成熟时间的延长，为抵抗肌肉ROS累积诱导的细胞凋亡，DJ-1的表达量持续增加，此时该蛋白通过调节多种抗氧化应激分子信号通路继续发挥作用。
2.2 ROS的变化
动物屠宰后细胞内ROS的大量积累及抗氧化能力的减弱会破坏正常的细胞信号通路，从而诱导凋亡程序的发生。ROS含量的增加是宰后秦川牛肌细胞氧化应激的主要标志。由图6可知，秦川牛宰后0～8 d的ROS相对含量呈显著上升的趋势（
P＜0.05），这可能是因为随着肌肉成熟时间的延长，线粒体内氧化磷酸化偶联过程受到阻碍，且细胞内抗氧化酶活性降低甚至完全失活，于是ROS会在细胞内大量累积 。Ding Zhenjiang等 研究发现宰后牛背最长肌的肌肉组织在成熟24～120 h过程中ROS相对含量显著上升趋势（
P＜0.05），本研究结果与其相似。
3 DJ-1表达量与肉品质指标及ROS的相关性分析
为探究秦川牛宰后成熟期间蛋白质DJ-1与肉品质及ROS相对含量变化的关系，对DJ-1的表达量与ROS相对含量及肉品质指标pH值、色度、离心损失、滴水损失、剪切力等进行Pearson相关性分析。由表2可知，DJ-1表达量与pH值呈极显著负相关（
P＜0.01），相关系数为-0.724；与剪切力呈显著负相关（
P＜0.05），相关系数为-0.352；与离心损失、
L*值、
b*值、ROS相对含量呈极显著正相关（
P＜0.01），相关系数分别为0.657、0.501、0.980、0.984；与
a*值、滴水损失无显著相关性（
P＞0.05）。相关性分析结果表明，DJ-1表达量对宰后秦川牛肌肉pH值、嫩度、离心损失及ROS有显著影响，可发挥抗氧化能力从而清除ROS，且对肉品质具有一定的调节作用。已知DJ-1由
PARK7基因编码且在真核生物中高度保守，细胞发生氧化应激时会被氧化，通过ROS介导并选择性地发生在该蛋白质的活性位点半胱氨酸残基上，其中C106位点对ROS高度敏感 。
动物屠宰放血后会发生骨骼肌蛋白降解和肌细胞的凋亡，进一步激发肉的嫩化过程，而DJ-1可作为肉类嫩度预测的候选蛋白。DJ-1通过保护
-钙蛋白酶免受ROS的氧化，消除宰后肉类中的自由基从而平衡肌肉细胞的氧化还原状态 。李可悦 发现猪背最长肌蛋白质DJ-1表达量的变化与ROS增加有关，肌细胞中ROS的增加可能会影响肌肉的生化代谢。ROS攻击肌原纤维蛋白导致的碎片化及其介导的DNA损伤会促进细胞凋亡，进而改善肉的嫩度 。因此推测高表达的DJ-1通过抑制ROS的释放调节抗氧化应激反应，维持钙蛋白酶活性，从而对肌细胞凋亡起到一定的促进作用，进而改善肉品嫩度。Jia等 通过二维凝胶电泳和蛋白质组学研究了与肉嫩度相关的蛋白质变化，发现挪威红牛的背最长肌中DJ-1表达量与肉嫩度呈显著正相关（P＜0.05），本实验结果与其基本一致。由表2可知，DJ-1表达量与pH值成极显著负相关（
P＜0.01），肌肉成熟阶段调节蛋白质的表达会启动糖酵解过程，在宰后早期阶段结构蛋白较快降解与DJ-1之间相互作用会加速肌肉的排酸过程 ，说明无氧糖酵解参与其中并受到抑制，因此生成乳酸的含量减少，pH值升高。此外，徐敏 发现在肌肉组织中敲除DJ-1后，通过调控ROS介导的线粒体偶联途径会促进骨骼肌糖酵解，使pH值下降，进而影响肉品质。DJ-1的增加可被视为动物宰后成熟期间色泽变化的潜在预测因子 ，本研究结果显示DJ-1与
L*值呈极显著正相关（
P＜0.01），这与Sayd等 的研究结果基本一致，由于DJ-1的半胱氨酸残基会保护细胞免受氧化应激，因此推测DJ-1的表达可能对宰后应激环境发挥某种保护机制 。有研究指出一些肉色生物标志物与色泽的相关性在禽畜品种之间是相反的 ，本研究发现DJ-1表达量与
a*值呈正相关，但相关性并不显著（
P＞0.05），与Gagaoua等 对牛半膜肌的研究结果不一致，由于肌红蛋白的含量是影响宰后肌肉色泽变化的主要原因，不同部位肌肉的肌红蛋白含量及氧化状态并不相同，因此造成DJ-1在不同品种不同肌肉类型中对肉色的影响有所差异。
DJ-1可防止肌细胞凋亡引起的蛋白质结构损伤和降解，细胞凋亡与细胞收缩及肌肉中水分流失密切相关，本研究发现DJ-1表达量与离心损失有极显著相关性，因此推测秦川牛肉DJ-1通过对细胞凋亡的调控进一步对离心损失产生影响。Liu Rui等通过蛋白质组学研究发现，猪肉中DJ-1表达量与滴水损失呈极显著负相关（
P＜0.01），本实验通过相关性分析得出DJ-1表达量与滴水损失相关性不显著（
P＞0.05），可能是动物饲养条件及品种、实验材料或样品处理方式不同所导致。
剪切力是评价肉嫩度的关键指标，主要受到肌肉水分含量及保水性、肌纤维直径及肌肉成熟的程度等多种因素的影响 。肌肉的保水性是反映其保留水分的能力，可用滴水损失和离心损失衡量，本研究发现离心损失和滴水损失分别与剪切力呈显著正相关（
P＜0.05）和极显著正相关（
P＜0.01），同时，滴水损失和离心损失也呈较高的相关性（
P＜0.01），此结果与李琳 的研究结果一致，这可能是因为肌原纤维蛋白在内源酶的作用下发生降解，导致肌纤维结构完整性及排列方式的变化，从而进一步影响肌肉的保水性与嫩度 。与Li Guixia等 研究宰后肉嫩度的改善中发现某些蛋白降解条带的出现或消失都与嫩度和保水性密切相关一致。本研究还发现pH值与滴水损失和离心损失呈极显著负相关（
P＜0.01），随肌肉pH值的下降以及肌原纤维附着在细胞膜上的蛋白质减少，会引起肌细胞的收缩加剧，并在重力作用下最终导致秦川牛肉的滴水损失和离心损失升高 ，这与陈明等 的研究结果一致。
4 蛋白质鉴定及组学分析
宰后秦川牛背最长肌在4 ℃成熟0～8 d后，其蛋白质表达发生了一定的变化。利用蛋白质组学共鉴定得到12 009 条肽段，1 438 个蛋白质，其中1 149 个蛋白质可以定量。样品经质谱检测，根据差异倍数（fold change，FC）≥1.3或FC≤0.769（1/1.3）筛选得到差异表达蛋白122 个（
P＜0.05），对3 个时间点（0、4、8 d）的差异蛋白进行相关性分析，如图7a所示，秦川牛背最长肌的差异蛋白在不同成熟时间重复性较好且样本之间差异较为明显。由图7b可知，有64 种上调蛋白质、59 种下调蛋白质。综上，样本在成熟不同时间时差异较大且具有显著差异，能够满足后续分析需求。
4.1 差异蛋白质筛选
有研究表明DJ-1在肌肉组织中大量表达，包括牛的背最长肌、半腱肌，羊的半膜肌和内股肌。由图5可知，宰后0～8 d蛋白质DJ-1表达量随着成熟时间的延长呈持续利用Uniprot对4D-LFQ蛋白组学所鉴定的可定量蛋白进行搜索，对宰后不同成熟时间秦川牛背最长肌中与DJ-1蛋白功能相关的差异蛋白进行筛选，再将这些蛋白与DJ-1表达量作相关性分析，如表3所示，共筛选出43 个差异蛋白，并且与DJ-1的表达量均显著相关。
4.2 GO功能富集分析
对DJ-1及差异互作蛋白进行GO功能富集分析，通过生物过程（BP）、细胞组分（CC）及分子功能（MF）3 个方面解析DJ-1的功能，发现其途径显著富集12 个BP、8 个CC及7 个MF，结果如表4所示。宰后成熟0～8 d的差异蛋白质在细胞内多聚体、细胞质、线粒体、线粒体基质、核质等方面发生变化，使蛋白质离子通道打开、发挥蛋白质均二聚活性、泛素蛋白连接酶结合以及抗氧化活性激活等，从而引起对氧化应激反应、泛素依赖性蛋白分解代谢、蛋白酶体蛋白分解、线粒体ATP合成耦合质子转运、线粒体裂变的积极调解以及糖酵解等，通过以上所参与的过程进一步调控秦川牛肉细胞新陈代谢、肌肉收缩。
4.3 KEGG通路富集分析
对DJ-1及差异蛋白进行KEGG通路富集分析，结果如表5所示，其显著注释于氧化磷酸化（bta00190）、糖酵解/糖异生（bta00010）、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路（bta04066）和内质网中的蛋白质加工（bta04141）途径。氧化磷酸化途径通过差异蛋白的表达调节氧化磷酸复合物的活性维持机体正常的代谢，其中NADH脱氢酶[泛醌]1
亚复合物亚基5（NDUFB5），可作为辅助亚基将电子转移至呼吸链中参与线粒体内膜的呼吸作用并调控脱氢酶的活性。COX7A1是细胞色素c氧化酶的成分，可驱动氧化磷酸化，协同呼吸链上的化合物、NADH和琥珀酸共同驱动跨膜转运。细胞色素c作为重要的凋亡相关因子，过表达会促进细胞凋亡的发生，通过调节线粒体呼吸电子链影响牛肉品质 。糖酵解途径是机体在缺氧环境下能量供应的重要途径，其中乳酸脱氢酶B（LDHB）是一种乙酰化蛋白，LDHB磷酸化会使丙酮酸的底物抑制作用被解除，提高乳酸活性，从而促进糖酵解中间体生物的合成，对维持肌肉pH值有重要作用 。果糖-二磷酸醛缩酶（ALDOC），是一种糖酵解酶，缺氧诱导因子HIF-1α可通过调节ALDOC的表达从而促进糖酵解过程 ，这种酶还可在生物体内通过发挥醛缩酶的活性参与果糖1,6-二磷酸代谢过程。磷酸丙酮酸水合酶（ENO）2，这种高度保守的蛋白质能催化2-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸之间的相互转化并在糖酵解中发挥关键作用 ，为细胞新陈代谢提供物质基础。HIF-1信号传导参与动物宰后缺血缺氧反应，姬琛等 研究表明HIF-1对宰后羊肉品质形成具有重要调控作用。CUL2蛋白为Cullin家族一员，通过与泛素蛋白连接酶结合对类泛素蛋白起修饰作用。由表4可知，PRDX1、CUL2、PARK7、DNAJA2参与内质网中的蛋白质代谢，其中PRDX1主要作为过氧化氢介导信号转导的传感器，可防止氧化应激并且在保护细胞方面发挥作用。DNAJA2为保守脱氧核糖核酸蛋白家族的一员，通过刺激ATP的水解，与热休克蛋白70（Hsp70）结合调节分子伴侣的活性。DJ-1与线粒体有密切的关系，会调节氧化还原平衡、抗氧化基因转录，从而阻止线粒体损伤导致的细胞凋亡；DJ-1对于细胞代谢调节具有重要作用，可调节糖酵解和氧化磷酸化之间的平衡 。以上结果表明，DJ-1通过与其他差异蛋白质共同作用调控肉品成熟过程中的生化代谢最终影响牛肉品质。
结论
秦川牛宰后0～8 d内，随着成熟时间的延长，pH值先下降后上升，L*值、
a*值、剪切力、离心损失和滴水损失先上升后下降，蛋白质DJ-1的表达量与
b*值、ROS持续上升。相关性分析结果显示，DJ-1表达量与pH值呈极显著负相关（
P＜0.01），与剪切力呈显著负相关（
P＜0.05），与离心损失、
L*值、
b*值、ROS相对含量呈极显著正相关（
P＜0.01），因此说明蛋白质DJ-1与秦川牛肉品质方面存在密切关系。4D-LFQ蛋白组学分析结果显示，宰后秦川牛蛋白质DJ-1及相关差异蛋白表达量在成熟过程中也呈现出了显著的变化，GO功能富集及KEGG通路富集分析结果表明蛋白质DJ-1通过与激酶结合、离子通道结合以及泛素蛋白酶等结合，引起糖酵解代谢、氧化应激反应对凋亡信号通路的调控，这些调控作用促使秦川牛屠宰放血后的肌肉结构发生变化，从而影响秦川牛的嫩度等肉品质。
本文《 秦川牛宰后成熟过程中蛋白质DJ-1对肉品质变化的影响机制》来源于 《食品科学》2024年45卷第 22 期 219 - 228 页，作者： 张 静，赵文秀，司健芳，曹松敏，李亚蕾*，罗瑞明 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20231208-074。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、四川轻化工大学食品与酿酒工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。
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为进一步深入探讨食品产业在当前复杂多变环境下的高质量发展路径，并着重关注食品科学、营养安全保障的基础研究与关键技术研发，贯彻落实“大食物观”和“健康中国2030”国家战略，北京食品科学研究院和中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志，将与国际谷物科技协会（ICC）、湖南省食品科学技术学会、湖南省农业科学院农产品加工研究所、湖南农业大学、中南林业科技大学、长沙理工大学、湘潭大学、湖南中医药大学、湖南农业大学长沙现代食品创新研究院共同举办“第十二届食品科学国际年会”。本届年会将于2025年8月9-10日在中国 湖南 长沙召开。
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