《食品科学》：北京工商大学马爱进教授等：凡纳滨对虾肌质钙结合蛋白纯化鉴定、理化特性及抗原表位分析

凡纳滨对虾（

Penaeus vannamei

截至目前，凡纳滨对虾中已有5 种过敏原蛋白被国际免疫学会联合会及WHO下设的过敏原命名小组委员会（www.allergen.org）认定并命名，分别为原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白轻链、肌质钙结合蛋白（SCP）和脂肪酸结合蛋白。SCP是引发虾过敏反应的主要过敏原之一。与其他甲壳类动物的过敏原相比，凡纳滨对虾SCP中鉴定出的免疫球蛋白（Ig）E结合表位较少，仍无法全面探究其表位的保守性。

北京工商大学食品与健康学院的陈伟、周军君、马爱进*以凡纳滨对虾SCP为研究对象，采用蛋白粗提、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析等步骤对其进行提取纯化；通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）对纯化蛋白进行鉴定；利用酶联免疫吸附测定（ELISA）法对凡纳滨对虾SCP的免疫活性、热稳定性、pH值稳定性和体外模拟胃肠消化稳定性进行分析；进一步采用圆二色谱表征其二结构；借助生物信息学工具结合竞争性酶联免疫吸附测定法（icELISA）对凡纳滨对虾SCP线性表位进行精准预测和鉴定，以期为后续SCP蛋白致敏性的消减研究提供一定参考。

1 SCP的分离纯化

对硫酸铵沉淀后所得的SCP粗提液进行SDS-PAGE，结果如图1所示。根据Alpha View SA 3.4.0电泳图像分析软件分析可知，粗提液中的蛋白质条带分子质量从上到下分别为134、108.2、78.4、45.5、40.1、36.8、29.2、21.6、16.6 kDa，其中主要蛋白质分子质量为40.1 kDa和21.6 kDa。研究表明，SCP分子质量约22 kDa，因此，初步判定分子质量为21.6 kDa附近的蛋白条带很可能是凡纳滨对虾SCP，纯度为13%。

如图2所示，SCP粗提液经过ANX Sepharose阴离子交换层析，第2洗脱蛋白峰中出现明显的分子质量为21.6 kDa的蛋白条带且第3洗脱蛋白峰中分子质量为21.6 kDa的条带颜色最深，且纯度较高，纯度达到84%。第4洗脱蛋白峰中有多个蛋白条带且分子质量为21.6 kDa的条带颜色较浅。

2 UPLC-MS/MS鉴定

将分子质量为21.6 kDa的条带经脱色、脱水、还原烷基化、酶切，经UPLC-MS/MS鉴定。如图3a所示，通过对酶解肽段进行MS/MS扫描确定其氨基酸序列，共鉴定得到54 条酶解肽段。经采集的原始数据采用ThermoFisher公司的Proteome Discoverer 1.4进行搜库，检索引擎使用SEQUEST，使用NCBI蛋白的氨基酸序列fasta文件为蛋白数据库，同时采用正反库搜索方法，将错误发生率控制在1%以内。结果表明，提纯得到的蛋白为UniProt数据库中收录的凡纳滨对虾ACP（Accession：ACM89179.1），分子质量为22.1 kDa，检测出的肽段覆盖率为93.26%，鉴定序列如图3b所示。

3 凡纳滨对虾SCP性质分析

3.1免疫活性

如图4a所示，相较于非致敏血清，纯化的SCP对过敏患者的血清池有很强的反应，说明本实验分离纯化得到的SCP具有良好的免疫活性。此外，SCP对10 位过敏患者的血清都有反应，且蛋白条带均有显色，其中第8位虾过敏患者的血清对SCP的识别最强，说明SCP是引起虾过敏患者过敏的重要过敏原（图4b）。

3.2热稳定性

如图5所示，热处理温度从4 ℃上升至45 ℃的过程中，SCP条带保持稳定，其IgE结合活性逐渐增强；当热处理温度上升至65 ℃时，SCP条带颜色变浅，IgE结合活性明显减弱；加热至90 ℃的过程中，SCP条带颜色和IgE结合活性没有明显变化；直至上升至100 ℃时，SCP条带近乎消失。这说明随着热处理温度的升高，凡纳滨对虾SCP的空间结构逐渐被破坏。温度上升至45 ℃时，其内部的抗原表位外露，使其IgE结合能力增强。热处理温度大于65 ℃时，SCP的二级结构和三级结构被破坏，使得整个蛋白分子呈线性结构，继而在热变性后再次折叠形成新的致敏结构，重新形成的蛋白结构相互作用，遮盖了部分线性表位，因而IgE结合活性变弱。

3.3pH值稳定性

如图6a所示，缓冲液的pH值为2～9时，SCP条带稳定；缓冲液的pH值为10.0和11.0时，SCP条带模糊，SCP发生降解。由图6b可知，缓冲液的pH 7.0与8.0时，IgE结合活性较强；pH值升至9.0时，IgE结合活性略有下降；随着pH值向更酸/碱的方向变化，IgE结合活性逐渐降低，且在强酸（pH 1.0～5.0）和强碱性（pH 10.0～11.0）环境下，SCP失去免疫活性。这些结果说明，凡纳滨对虾SCP在经过强酸处理后，在低于等电点（5.06）的条件下，蛋白质分子内部发生相同电荷的相互排斥，导致其构象结构的破坏和致敏性的显著降低；在极端碱性条件下，SCP分子会发生严重变性，破坏其构象表位和线性表位，使其失去免疫活性。

3.4消化稳定性

如图7a所示，SCP在模拟胃液消化至1 min时开始降解，随着反应不断进行，SCP条带逐渐变浅，在其下方生成了一系列小分子降解条带；消化至10 min时，SCP条带完全降解。如图7b所示，随着模拟胃液消化反应的进行，消化的SCP对未消化的SCP竞争抑制率逐渐降低，消化至60 min时，竞争抑制率近乎为零，表明此时消化的SCP失去免疫活性。

如图8a所示，相对于模拟胃液消化，SCP在模拟肠液中的消化速率则较为缓慢。SCP在消化至1 min时开始降解，随着消化时间的延长，SCP条带逐渐变模糊，生成了一系列小分子质量的蛋白条带，但直至240 min，SCP条带仍未被完全降解。如图8b所示，消化的SCP对未消化的竞争抑制率随消化时间延长逐渐降低，但是直至消化至240 min时，竞争抑制率仍保持在32%，表明此时消化的SCP还具有一定的免疫活性。

这些结果说明，凡纳滨对虾SCP对肠液消化具有较强的稳定性，能被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶初步降解产生一系列多肽、氨基酸或其他小分子，改变其空间构象，但二级结构基本保持完整。但是，SCP对胃蛋白酶的耐受性较差，会被迅速降解，结构变得松散无序。这些结果很可能与凡纳滨对虾SCP的氨基酸组成有关，由于胃蛋白酶和胰蛋白酶、糜蛋白酶作用的氨基酸不同，所以消化结果会存在差异。

4 凡纳滨对虾SCP二级结构的表征

如图9a所示，凡纳滨对虾SCP在193 nm波长处有1 个明显的正峰谱带，在208 nm（α-螺旋肽键的π-π*跃迁）和222 nm（

n

5 凡纳滨对虾SCP线性表位分析

5.1凡纳滨对虾SCP线性表位预测

根据凡纳滨对虾SCP的氨基酸序列（ACM89179.1），该蛋白共由193 个氨基酸组成。利用DNAStar Protean分析凡纳滨对虾SCP一级结构的亲疏水性、溶剂可及性、可塑性和抗原指数等指标，对凡纳滨对虾SCP的线性表位进行预测。生物信息学在线工具IMED和IEDB通过分析氨基酸的理化性质，综合预测出可能性高的过敏原表位。表1列出了各生物信息学软件对凡纳滨对虾SCP线性表位的预测结果。

由于每种软件都有一定的局限性，因此，对3 种预测方法得到的表位进行综合分析，筛选至少2 种工具共同预测出的过敏原表位为凡纳滨对虾SCP候选表位，如表2所示，共筛选得到10 条候选表位序列。

5.2凡纳滨对虾SCP候选表位验证

采用上述10 名虾致敏患者血清池进行icELISA，检测10 条候选表位多肽与纯化SCP对IgE的竞争结合能力。如图10所示，P1、P2、P4、P5、P6、P7、P8、P9能够抑制SCP与血清中IgE的结合。对多肽抑制率曲线进行线性回归，得到线性回归方程和IC50。如表3所示，P4、P9的IC50较小，分别为7.932 4 μg/mL和6.479 5 μg/mL，说明这2 条表位多肽对致敏患者血清的亲和力较强。经验证，8 条表位多肽均为凡纳滨对虾SCP的潜在抗原表位。

目前，甲壳类动物SCP已有多条抗原表位被预测识别，如葡萄牙牡蛎（

Crassostrea angulata

C. gigas

Scylla paramamosain

P. vanmamei

结论

以凡纳滨对虾为原料，通过蛋白粗提、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析等步骤得到了较为纯净的分子质量为21.6 kDa的蛋白。经UPLC-MS/MS鉴定，纯化蛋白确为凡纳滨对虾SCP，肽段覆盖率高达93.26%。经过进一步研究发现，凡纳滨对虾SCP具有较强的免疫活性和一定的热、pH值稳定性，其免疫活性在热处理温度≥65 ℃和强酸强碱条件下会有一定程度的减弱。此外，SCP对肠液消化具有较强的稳定性，而对胃液消化稳定性较差。利用圆二色谱对凡纳滨对虾SCP的二级结构进行分析，

作者简介

通信作者：

马爱进 教授

北京工商大学食品与健康学院

教育经历：

2009.06-2011.07 中国农业大学食品科学与营养工程学院获博士学位

1998.08-2001.10 河北农业大学食品科学系获硕士学位

1994.10-1998.07 河北农业大学食品科学系获学士学位

工作经历：

2019.06-至今 北京工商大学食品与健康学院 教授

2006.07-2019.05 中国标准化研究院

2001.11-2006.06 中国农业科学院畜牧研究所

主讲课程：

《食品微生物学》、《食品酶工程》、《食品法规与标准》

主要研究领域：

食品与生物技术、酶与蛋白质

承担的主要科研项目（限5项）：

主持了科技部国家重点研发计划项目“生物产业共性技术标准研究（2016YFF0202300）”、科技部国家重点研发计划课题“蛋白质和酶功效评价与检测技术标准（2016YFF0202302）”、中国科学院战略性先导科技专项子课题“器官重建与制造类细胞标准化质量特性研究（XDA16040501）”、国家自然基金“虾类肌质钙结合蛋白及其亚基的过敏原性与构效关系的研究”、国家质检公益科研专项子项目“重要核酸生物技术30项国家标准研制”等科研项目。

第一作者：

陈伟，男，博士研究生，研究方向为食品微生物资源的开发与应用。

本文《凡纳滨对虾肌质钙结合蛋白纯化鉴定、理化特性及抗原表位分析》来源于《食品科学》2024年46卷第2期30-37，作者：陈 伟，周军君，陈雅纯，贾英民，马爱进*。DOI : 10.7506/spkx1002-6630-20231023-190。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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