单细胞测序可以从DNA、RNA、表观遗传和蛋白质水平揭示分子驱动因素，是癌症研究的关键工具之一。但大多数单细胞测序由于前期仪器（例如微流控设备）成本高昂和文库制备操作繁琐等因素，并不能满足大多数规模实验室的需求。近期，因美纳推出了基于PIPseq（粒子模板即时分区）化学技术的Illumina Single Cell 3' RNA Prep（以下简称ISCP），进一步扩大了单细胞测序的应用覆盖范围。
ISCP是一款易于使用且高度可扩展的单细胞测序解决方案，可实现mRNA捕获、条码编制和文库制备，无需复杂的工作流程或微流控技术。ISCP可用于多种物种不同样本类型的单细胞测序，具有快速、灵活、高通量、高质量等多个领先优势，可为研究人员提供更加便捷、经济的使用体验，满足不同规模实验室的多层次研究需求，为癌症研究带来更多可能。
癌症单细胞测序可以更经济高效
单细胞测序已被广泛用于癌症研究，包括检测突变、预测转移风险、分析免疫异质性、指导靶向治疗等。但癌症本质上是一个高度异质且动态演化复杂多变的生态系统，涵盖多种细胞类型，这些细胞共同影响着癌症的发展和对治疗的响应。目前，无论是研究还是临床诊断，单细胞测序的应用仍然面临着各种挑战，远未被常规使用。
01
复杂的样本类型
癌症单细胞测序会涉及不同物种的不同样本类型，包括新鲜组织、血液、体液、冷冻组织、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本、类器官、细胞系以及动物模型等，不同样本的制备方案也存在差异。
通常，单细胞测序首选新鲜样本。新鲜样本能够保持样本最原始组织活性状态，有助于获得高质量的单细胞悬液。在肺癌研究中，单细胞RNA测序被用于新辅助免疫治疗前后非小细胞肺癌新鲜样本的肿瘤微环境重塑分析[1]，发现不同治疗诱导的癌细胞转录组与临床反应相关，不同病理反应的患者治疗后微环境重塑存在显著差异。此外，FCRL4+FCRL5+记忆B细胞和CD16+CX3CR1+单核细胞的转录本在主要病理反应患者中富集，并且是免疫治疗反应的预测因子。
肿瘤动物模型是连接实验室研究与临床治疗的重要桥梁，常用于探索肿瘤机制、评估新药疗效及安全性。张莹等[2]研究人员构建了小鼠乳腺癌模型，并分为早期肿瘤组和晚期肿瘤组，通过单细胞RNA测序发现晚期肿瘤抑制抗肿瘤免疫基因，减少浸润性免疫细胞和肿瘤免疫细胞间的通讯；早期肿瘤中初始和活化的CD8+ T细胞在晚期肿瘤中被耗尽或前体耗尽的细胞所取代。此外，在肿瘤进展过程中，免疫及炎症相关的通路和基因均呈现出下调趋势。
图：PD-1阻断和化疗联合治疗前后可切除非小细胞肺癌的单细胞转录组分析，揭示肿瘤微环境的动态变化。[1]
为满足单细胞测序的多样化应用场景需求，因美纳推出的ISCP对人类、小鼠等物种的不同样本类型具有良好的普适性，扩大了单细胞测序的覆盖范围以及癌症各样本类型的可用性，可为癌症研究提供更精细、更全面的生物信息。例如，加州大学旧金山分校研究团队使用ISCP分析了混合表型急性白血病的血液样本[3]，以检测化疗耐药细胞亚群的异质性，揭示了标准免疫分型无法检测到的细胞亚群特征。
图：白血病患者的临床流式细胞分析和相应PIPseq抗体衍生标签分析。[3]
由于样本保存、运输方面的挑战以及样本类型、批次效应的限制，利用新鲜样本进行癌症单细胞测序并不总是容易实现，为核酸提取和测序带来了挑战。随着技术的进步，目前已经可以对新鲜样本进行DSP-甲醇固定，用于后续单细胞分析，这可以进一步丰富单细胞测序的应用场景，提高临床癌症样本的利用率。
02
快速样本制备
单细胞测序能够准确解析样本的细胞组成以及容易被忽略的、脆弱关键细胞亚型，这些罕见或独特的细胞亚型可能在癌症中发挥重要作用。
胰腺癌作为癌症之王，不仅生存率低，其样本活性同样很低，从人体中取出后会自动消化，因此胰腺癌样本的保存和解离是单细胞测序领域的重要难题之一。王红霞等研究人员利用单细胞RNA测序，首次系统解析了胰腺导管腺癌微环境中癌症相关成纤维细胞（CAF）的分子全景及其异质性亚型[4]。但该研究中CAF亚型的细胞数量相对较少，这可能导致统计效力不足。
对于富有挑战性的样本，样本制备过程的优化会影响数据质量。2022年，张宁等研究人员首次在单细胞水平全面揭示了肝癌的免疫微环境亚型和中性粒细胞异质性等[5]。由于中性粒细胞非常脆弱，在体外环境很容易死亡，该研究利用优化的快速实验流程，成功捕获到3万多个脆弱的中性粒细胞，并鉴定出6个肿瘤相关中性粒细胞亚群，为肝癌的基础研究和临床诊疗提供了关键信息。
图：胰腺导管腺癌和正常胰腺组织中所有细胞的单细胞图谱。[4]
快速样本制备有助于保持样本的完整性，以提高靶标细胞的捕获效率。与按顺序形成油包水液滴的微流控方法不同，因美纳ISCP使用涡旋混合器，2分钟即可快速乳化捕获细胞。无论是脆弱的免疫细胞还是胰腺癌等特殊样本，ISCP都能温和地进行同时捕获，最大程度地保留最原始细胞的活性状态，获得高质量的单细胞悬液，为后续实验的稳定性和准确性提供保障。
ISCP的快速样本制备不仅减少了对样本运输的需求，还允许需要特殊预防措施的传染性样本的安全处理，最大限度地减少了转录扰动和与处理许多样本相关的批量工作。
图：ISCP快速乳化捕获细胞。[3]
03
灵活可拓展
单细胞测序可以更好地理解肿瘤内部的复杂生态，同时发现新的罕见细胞类型和亚型，识别新治疗靶点，有潜力革新癌症的诊断、治疗和预后策略。近年来备受青睐的单细胞泛癌研究就是一个很好的应用案例。
张宁等[5]研究人员通过分析肝癌和小鼠模型的130万个单细胞测序数据，综合解析了肝癌的免疫微环境亚型和中性粒细胞异质性，辅助发现新的生物标志物和免疫治疗靶标。2025年，白凡团队[6]通过整合的单细胞测序分析，构建了迄今为止最大规模泛癌脑转移单细胞图谱，研究了不同肿瘤谱系和亚群中细胞状态和组成的特征和重塑，对脑转移瘤的治疗具有重要临床意义。
图：泛癌脑转移单细胞图谱研究概要。[6]
类似的大规模单细胞分析需要高通量测序解决方案的支持。单次的捕获细胞数量越多越能减少实验批次效应，同时多样本的并行单细胞捕获，也有助于降低研究成本。但某些癌症样本量可能比较少，其中某些细胞类型含量更是极少，可能无法在Bulk转录组水平检测到，而这些细胞有可能对于癌症免疫治疗、新免疫疗法或获得性耐药性反应至关重要。
例如，在癌症临床研究中发挥重要作用的样本量极小的穿刺样本以及癌症免疫治疗的研究热点NKT细胞。利用单细胞测序分析同步切除的胰腺导管腺癌原发肿瘤新鲜样本和匹配肝转移瘤的穿刺样本[7]，发现肝转移瘤中的肿瘤细胞表现出独特的转录组特征，具有明确的从原发性肿瘤细胞进化的途径。该研究还鉴定了转移性病变中对促肿瘤微环境形成至关重要的基质细胞和免疫细胞的特定亚型。NKT细胞是一种介于先天免疫和适应性免疫的T细胞，含量少，约占外周血T细胞的0.1%。有研究表明，食管癌外周血中TRGC2+ NKT细胞是治疗反应相关的潜在生物标志物。[8]
图：原发和匹配转移性胰腺导管腺癌组织中的单细胞测序研究流程。[7]
对于样本量极小或者靶标细胞含量极低的特殊样本，适配的细胞数量分析规格以及高效的细胞捕获可在提高数据质量的同时避免试剂浪费。因美纳ISCP以试剂为基础，液滴数量与粒子模板的数量成正比，并且试剂盒经过预先分配提供支持，不受测序细胞数量的限制，因此一次可处理一个样本，或制备少量细胞。同时，ISCP的细胞捕获率可达50%-85%的水平，多胞率更低（2%-8%），能够缓解因稀缺样本中初始细胞数量有限而导致的细胞捕获率过低等问题，可提供更加准确的高质量单细胞测序数据。
图：PIPseq在不同大小试管(1.5毫升、15毫升和50毫升)中进行的颗粒模板乳化，可对不同数量级的细胞数进行条形码化。来源：因美纳官网
目前，ISCP的试剂盒配置了四种规格（T2、T10、T20、T100），可以支持100个至100万个细胞的分析，能够满足低细胞多样性试验以及复杂组织分析的不同规模研究需求。实验室可根据实际需求灵活选择试剂规格，使癌症单细胞测序更加经济高效。
结 语
癌症是一种由多种遗传克隆和恶性细胞状态组成的复杂生态系统，其内部有着非常高的异质性。单细胞测序能够解析这种复杂性，为理解肿瘤生物学提供了革命性的视角。
因美纳推出的ISCP工作流程易于实施，无需昂贵的微流控设备。广泛兼容、制备快速、通量灵活的特点使ISCP能够帮助任何规模的实验和实验室进行大规模、多样化的单细胞测序研究，而不受预算或技术的限制，为多样化的单细胞测序场景提供了更高效、经济、稳定的解决方案。
图：ISCP工作流程。PIPseq化学技术帮助解决了高通量单细胞制备问题，Illumina NovaSeq™ X测序仪可以高效地进行转录组测序，DRAGEN™ Single Cell流程和Partek™ Flow™ 软件可以分析大量测序数据。来源：因美纳官网
参考文献
[1]Hu, J., Zhang, L., Xia, H. et al. Tumor microenvironment remodeling after neoadjuvant immunotherapy in non-small cell lung cancer revealed by single-cell RNA sequencing. Genome Med 15, 14 (2023). https://doi.org/10.1186/s13073-023-01164-9
[2]Zhang, Y., Naderi Yeganeh, P., Zhang, H. et al. Tumor editing suppresses innate and adaptive antitumor immunity and is reversed by inhibiting DNA methylation. Nat Immunol 25, 1858–1870 (2024). https://doi.org/10.1038/s41590-024-01932-8
[3]Clark, I.C., Fontanez, K.M., Meltzer, R.H. et al.Microfluidics-free single-cell genomics with templated emulsification. Nat Biotechnol 41, 1557–1566 (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01685-z
[4]Mengyu Tao,et al. Transcriptome Landscape of Cancer-Associated Fibroblasts in Human PDAC. Advanced Science, 2025.https://doi.org/10.1002/advs.202415196
[5]Xue, R., Zhang, Q., Cao, Q. et al. Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity. Nature 612, 141–147 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05400-x
[6]Xudong Xing, et al. Pan-cancer human brain metastases atlas at single-cell resolution. Cancer Cell, 2025.https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(25)00126-6
[7]Zhang, S., Fang, W., Zhou, S. et al. Single cell transcriptomic analyses implicate an immunosuppressive tumor microenvironment in pancreatic cancer liver metastasis. Nat Commun 14, 5123 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40727-7
[8]Shang X, Xie Y, Yu J, et al. A prospective study of neoadjuvant pembrolizumab plus chemotherapy for resectable esophageal squamous cell carcinoma: The Keystone-001 trial. Cancer Cell, 2024, 42(10): 1747-1763.
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