摘要：癌症严重威胁人类健康，传统治疗手段存在局限，免疫治疗成为新热点。其中，以纳米颗粒为载体/佐剂的纳米疫苗展现出显著疗效，而CpG ODN作为常用佐剂，能激活免疫应答。本文将详细介绍 CpG 的类型与特性，按其在纳米疫苗中的负载方式（静电吸附、共价结合等）综述代表性肿瘤纳米疫苗的研究进展，最后探讨当前挑战与未来展望，为癌症免疫治疗纳米疫苗的发展提供参考。

一、癌症与免疫治疗：现状与挑战

癌症是全球重大健康威胁，其高发病率和死亡率令人担忧。癌细胞源于正常细胞，早期难以监测和清除，还易逃避免疫系统监视，发生转移。目前，癌症治疗仍以手术、化疗和放疗等传统方法为主，但面对临床高发的癌症病例和可怕的死亡率，这些方法显得力不从心。

近年来，免疫治疗成为抗癌新策略，它能重新启动和维持肿瘤免疫循环，恢复机体正常抗肿瘤免疫反应，达到控制或清除肿瘤的目的。癌症免疫治疗主要包括过继性淋巴细胞疗法、生物靶向抗体、肿瘤疫苗和免疫检查点阻断等。其中，肿瘤疫苗因安全性高、易制造和储存方便，成为研究热点，但基于蛋白质和肽的亚单位抗原疫苗存在免疫原性差、稳定性不可靠、体内易降解等问题，只能诱导短期免疫反应，难以达到有效治疗效果。

二、CpG：强大的免疫佐剂（一）CpG 的结构与作用机制

CpG ODN是一种短链单链合成 DNA，其序列由胞嘧啶三磷酸脱氧核苷酸（“C”）和鸟嘌呤三磷酸脱氧核苷酸（“G”）组成，“p” 表示相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，C 位于 5' 端，G 位于 3' 端。这种序列在细菌和其他原核生物 DNA 中广泛分布，能刺激小鼠和人类淋巴细胞，而在哺乳动物中分布较少且多为甲基化抑制状态。

未甲基化的 CpG 基序被哺乳动物识别为病原体相关分子模式（PAMPs），被淋巴细胞（如浆细胞样树突状细胞（pDCs）和 B 细胞）吞噬后进入内体，被模式识别受体（PRR）Toll 样受体 9（TLR9）识别，进而诱导先天和后天免疫反应。

（二）CpG 的类型与特性

根据对人外周血单核细胞（PBMC），尤其是 B 细胞和 pDCs 的作用，CpG ODN 可分为 A、B、C、P、S 五种类型，其中 A、B、C 型对刺激人类免疫细胞尤为有效：

  • A 型 CpG：含部分 PS 修饰的硫代磷酸酯 - 磷酸二酯 - 硫代磷酸酯嵌合 backbone，有单个六聚体嘌呤 - 嘧啶 - CG - 嘌呤 - 嘧啶 CpG 基序，侧翼回文序列形成茎环结构，3' 和 / 或 5' 端有三个或更多连续聚鸟苷（poly-G）序列，能有效激活自然杀伤细胞（NKs），诱导 pDCs 分泌大量肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）和干扰素 -α（IFN-α），促进 APC 成熟，但对 B 细胞激活或 Th1 型细胞因子分泌几乎无作用。

  • B 型 CpG：由含一个或多个 CpG 基序的线性化寡核苷酸序列组成，具全 PS 修饰 backbone，是 B 细胞的强刺激剂，能诱导 B 细胞和单核细胞增殖并分泌白细胞介素 - 6（IL-6），促进免疫球蛋白 M（IgM）产生，还能诱导 Th1 型免疫反应，促进 Th1 细胞因子（如 TNF-α）产生，诱导 pDCs 成熟，上调共刺激分子表达，缓解肿瘤微环境（TME）的免疫抑制状态。

  • C 型 CpG：兼具 A、B 型特性，有完整 PS backbone，5' 端有代表性 B 型 CpG 基序，3' 端有类似 A 型的含 CpG 基序的刺激回文序列，能形成茎环或二聚体结构，可诱导 pDCs 分泌细胞因子 IL-12 激活 NKs 和 IFN-α，有效刺激 B 细胞活化增殖，促进 IL-6、IgM 和 TNF-α 等免疫活性物质分泌，同时激活先天和获得性免疫。

三、CpG 纳米疫苗：负载方式与应用进展

游离 CpG ODN 在临床应用中面临细胞膜静电排斥、易被核酸酶降解、半衰期短等问题，而CpG 纳米疫苗通过纳米颗粒负载可延长半衰期、增强向 APC 和淋巴结（LNs）的递送、改善免疫反应，成为癌症免疫治疗的新方向。以下按 CpG 在纳米疫苗中的负载方式进行综述：

（一）静电吸附负载

利用 CpG ODN 的负电荷特性，构建合适的正电荷纳米颗粒载体，通过静电吸附引入 CpG，该方法工艺简便，无需过多化学修饰，能较好保留佐剂免疫活性：

  • 刘等人制备的两亲性阳离子共聚物组装纳米颗粒，通过静电相互作用吸附负电荷的 CpG ODN 和抗原肽 E75，显著诱导强烈免疫刺激反应，促进 DC 成熟和 T 细胞活化，实现高效抗肿瘤免疫效果。

  • 关等人开发的纳米疫苗，用带正电的聚乙烯亚胺（PEI）通过静电作用吸引负电的模型抗原卵清蛋白（OVA）和 CpG，可被 DC 有效吞噬，辅助内体逃逸，促进抗原交叉呈递。

  • 金等人设计的基于小脂质纳米颗粒（SLNP）的纳米平台，通过静电吸附将负电荷 CpG 与阳离子分子结合，结合 OVA 肽后在 E.G7 肿瘤模型中展现出色抗肿瘤活性，与 PD-1 抗体联合使用效果更佳。

（二）共价结合负载

通过化学修饰使 CpG 与纳米载体形成共价键，是一种更稳定的负载方式：

  • 王等人设计的纳米疫苗，完全由抗原 OVA 和少量 CpG 佐剂组成，借助疏水调节剂十二烷基磺酸钠（SDS）作用，通过巯基相互作用形成含二硫键网络的自组装 OVA 纳米颗粒，并与巯基修饰的 CpG 形成二硫键，强烈诱导 CTLs，实现显著抗肿瘤效果。

  • 刘等人用疏水仿生磷脂材料 DOPE 作为载体，通过 SPDP 作用将 DOPE 吡啶二硫醇化，再与巯基末端的亲水性佐剂 CpG ODN 形成二硫键，负载 OVA 后构建的仿生纳米疫苗能提供持续有效抗原刺激，增强抗肿瘤免疫力。

  • 朱等人开发的白蛋白 / 白蛋白结合疫苗（AlbiVax）纳米复合物，巯基化 CpG 与马来酰亚胺功能化的伊文思蓝（EB）衍生物通过硫醚共价键交联，稳定负载 CpG，引发强烈 CTLs 反应，与免疫检查点抑制剂联合可增强癌症免疫治疗效果。

（三）亲水 - 疏水相互作用负载

利用亲水 - 疏水相互作用封装 CpG，可实现防止降解、延长半衰期、控制释放等优势：

  • 赵等人用反相蒸发法制备负载 CpG 和 E7 肽的脂质体纳米疫苗，经甘露糖修饰后可精准靶向 DCs，增强细胞免疫，诱导强烈抗肿瘤效应。

  • 赛恩斯等人用 PLGA 纳米颗粒共封装 CpG 和 α- 半乳糖神经酰胺（GalCer），在黑色素瘤小鼠模型中协同作用，展现高度抗肿瘤效果，显著抑制肿瘤生长。

  • 科凯特等人用溶剂蒸发技术制备可生物降解的 PLGA 纳米颗粒，共封装肿瘤抗原和 CpG，有效促进骨髓来源 DC 成熟活化，诱导强烈 CTLs 免疫反应，抑制肿瘤生长。

（四）DNA 自组装负载

随着核酸纳米技术发展，利用 CpG DNA 兼具免疫佐剂和纳米疫苗载体材料功能，通过 DNA 自组装引入 CpG：

  • 张等人构建的自组装 DNA 纳米花（NFs），含免疫刺激能力，通过 T4 DNA 连接酶作用将含三个 CpG 互补序列的线性模板连接成环状结构，再经 Φ29 DNA 聚合酶滚环复制（RCR）和液晶自组装得到 CpG NFs，可有效负载抗原。

  • 朱等人构建的 DNA - 无机杂化纳米疫苗，含 CpG 序列和无机焦磷酸镁（Mg₂PPi），线性化含 CpG 序列的 DNA 模板经 T4 连接酶环化后，通过 RCR 生成大量串联 CpG 类似物，加入镁离子形成 Mg₂PPi 沉淀 CpG 类似物，自组装成纳米疫苗，能被 APC 有效吸收，产生有效免疫刺激。

  • 朱等人还构建了自组装 DNA-RNA 纳米疫苗，通过 RCR 和滚环转录（RCT）过程共结晶核酸和无机补充剂，构建串联 DNA 和短发夹 RNA（shRNA）纳米结构，自组装成缠绕 DNA-RNA 纳米胶囊（iDR-NCs），负载肿瘤新抗原后可诱导强烈免疫刺激反应，显著抑制结直肠肿瘤生长。

（五）其他负载方法

  • 钱等人构建的 α-AP-FNPs 载体，负载三种不同抗原肽序列，将胆固醇修饰的 CpG 插入纳米颗粒表面磷脂中，未负载 CpG 的纳米疫苗可诱导特异性抗肿瘤免疫反应，负载后抗肿瘤功效更强。

  • 蒯等人用高密度脂蛋白（sHDL）纳米盘作为载体，将新抗原 - 脂质偶联物和胆固醇修饰的 CpG 通过疏水相互作用插入纳米盘，诱导强烈免疫反应，激活特异性 CTLs，与免疫检查点抑制剂联合使用抗肿瘤效果更显著。

  • 蔡等人用四（4 - 羧基苯基）卟啉（H₂TCPP）和锆离子构建金属 - 有机框架（MOF），通过其多孔内部结构负载吖啶黄（ACF），超声处理使 CpG 均匀分布在 MOF 表面，再涂覆透明质酸（HA），可与光动力疗法联合用于癌症治疗。

四、挑战与未来展望

尽管 CpG 负载纳米疫苗研究取得令人振奋进展，但仍面临诸多挑战：

  • 作用机制有待深入：纳米疫苗在体内的行为与理化性质参数和患者疾病状态密切相关，需全面理解其复杂关联。

  • 临床转化问题：多数纳米疫苗未进行临床评估，涉及安全性、实用性和有效性等亟待解决的临床问题，构建纳米颗粒的材料可能产生不良反应，且制备成本高阻碍发展应用。

  • 动物模型局限性：动物模型无法完全模拟人体复杂生理病理环境和肿瘤实际发展情况，部分纳米疫苗基础研究有效但临床转化效果不佳。

未来，需进一步阐明作用机制，优化纳米疫苗设计，提高安全性和实用性，加强从基础研究到临床转化的考量，确保癌症免疫治疗对广大患者有效可用。

五、结论

本文综述了基于 CpG 的癌症免疫治疗纳米疫苗的研究进展，详细介绍了 A、B、C 型 CpG ODN 的特性，按静电吸附、共价结合、亲水 - 疏水相互作用、DNA 自组装等负载方式阐述了代表性纳米疫苗，分析了从基础研究到临床转化的挑战。希望为癌症免疫治疗纳米疫苗的发展提供有价值参考。

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