非酶糖基化是指在无酶参与的情况下，还原糖的羰基与氨基酸、胺、蛋白质或各种形式的游离氨基之间的反应，这一过程在食品加工和储存中，特别是在食品蛋白质修饰中起着重要作用。它不仅能够通过美拉德反应改善食品的质地、色泽、香气和风味，而且可增强蛋白质的功能特性。然而，糖基化也会导致有害化合物的形成。
大量研究表明，多酚可通过清除自由基、螯合金属离子、捕获活性羰基化合物和影响蛋白质的空间结构等多种方式抑制糖基化过程和糖基化产物的形成。斯皮诺素（SP）是从酸枣仁中分离得到的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、镇静、催眠、改善认知功能、抗癌和抗焦虑等多种生物活性，因此SP具有潜在抑制AGEs形成的能力，但目前关于SP抑制AGEs的作用及其潜在机制的研究鲜有报道。
-乳球蛋白（-Lg）是牛乳清蛋白中的主要成分。然而，牛奶蛋白在加工过程中常发生非酶糖基化反应形成AGEs，危害人体健康。基于此，天津商业大学生物技术与食品科学学院的王朔、张彦青*和天津中医药大学中药学院的解军波*选择-Lg作为目标蛋白评价SP对-Lg-MGO非酶糖基化体系的抑制作用及潜在机制，以期为SP的开发利用和抑制非酶糖基化的研究提供新的思路。01
SP对AGEs形成的抑制作用
AGEs是蛋白质、核酸、脂类和其他大分子的游离氨基末端与葡萄糖或其他还原糖的醛基或酮基发生非酶促反应后产生的稳定且不可逆的共价化合物。二羰基化合物如MGO、乙二醛（GO）和3-脱氧葡糖醛酮（3-DG）是高活性化合物，可以促进AGEs的形成和氧化应激。本研究制备了
-Lg-MGO糖基化模型，并用荧光AGEs形成的变化评价SP对蛋白糖基化的抑制作用，这可以通过反应体系的荧光强度直接反映出来。荧光强度越高，糖基化程度越高。如图1A所示，随着孵育时间的延长，AGEs的含量逐渐增加，表明糖基化体系制备成功。图1B反映了不同浓度的SP（40、80、160 μmol/L）分别在第1、3、5天对AGEs形成的抑制率，随着孵育时间的延长，同一浓度的SP对AGEs形成的抑制率均呈现先下降再逐渐趋于平稳的趋势，因此推测SP对AGEs形成的抑制率与AGEs的形成速率有关，孵育后期AGEs的形成速率加快导致SP对AGEs的抑制效果下降。此外，在孵育的5 d内，SP对AGEs的抑制率均呈现剂量依赖性，SP浓度越大，对AGEs的抑制效果越好。图1C、D是孵育第5天时SP对AGEs的抑制作用，-Lg-MGO的最大荧光强度为9 907，当添加40、80 μmol/L和160 μmol/L的SP时，其荧光强度分别降至6 072、3 382和1 506，对糖基化的抑制率分别为38.71%、65.86%和84.80%，而1 mmol/L的AG对AGEs的抑制活性仅为55.5%，这些结果表明SP是一种优良的抗糖基化剂。02
SP对糖基化体系褐变程度的影响
AGEs是美拉德反应晚期阶段的产物，由一系列复杂的化学反应得到，在此阶段会产生一种导致褐变的色素类产物——类黑精素，其含量与美拉德反应程度直接相关，可通过波长420 nm处的吸光度评估。如图2A所示，天然的
-Lg为无色透明溶液，而-Lg-MGO则呈现出浅黄色，表明糖基化过程中产生了褐色物质，颜色变化较明显。结合AGEs含量测定结果（A 420 nm ，图2B），也说明美拉德反应促进了样品中AGEs的生成。然而，当-Lg在SP或AG存在下糖基化时，褐变有一定的缓解。由此可见，SP和AG可直接通过减缓美拉德反应晚期阶段的进程减少AGEs的产生。03
SP对蛋白质氧化产物的影响
糖基化与糖氧化同时发生，导致一系列氧化反应与自由基和活性氧的产生。在氧化应激下，一些芳香族氨基酸如Trp可以被修饰，从而形成二酪氨酸和
N′-甲酰基犬尿氨酸。而Tyr可以转化为二酪氨酸，这与蛋白质交联有关。如图3所示，40、80 μmol/L和160 μmol/L的SP对二酪氨酸、犬尿氨酸和
N′-甲酰基犬尿氨酸的形成均有良好的抑制作用，其中160 μmol/L的SP对3 种蛋白质氧化产物的抑制率最好，显著高于阳性对照AG。
04
紫外-可见吸收光谱
紫外扫描分析是一种常见的分析蛋白质空间构象变化的方法。
-Lg在紫外区的吸收波长主要在280 nm左右，这与其分子中的芳香族氨基酸如Tyr、Trp和苯丙氨酸等氨基酸残基有关。因此，可采用紫外扫描的方法来研究糖基化处理对-Lg空间结构的影响。由图4可知，将MGO与-Lg在37 ℃孵育5 d，在280 nm处的吸光度呈时间依赖性增加，在280 nm处观察到的吸收强度增加说明MGO的加入在不同程度上打开了-Lg的蛋白质分子结构，使-Lg分子内部的芳香族氨基酸暴露于蛋白质表面，也可能是MGO处理使蛋白质结构展开，从而有利于-Lg与MGO发生糖基化反应，产生更多的AGEs。05
SP对糖基化β-Lg结构的影响
5.1 SP对糖基化过程中自由氨基和巯基的影响
蛋白质中的自由氨基和巯基在稳定蛋白质构象和保持蛋白质活性方面起重要作用。此外，蛋白质中的自由巯基含量还可以直接反映半胱氨酸、组氨酸等氨基酸的氧化修饰比例。如图5所示，与
-Lg相比，-Lg-MGO的自由氨基和巯基含量均下降，而随着SP浓度从40 μmol/L增大到160 μmol/L，糖基化-Lg的自由氨基和巯基含量均有所增加，当添加SP的浓度为160 μmol/L时，体系中的自由巯基含量最高，效果甚至强于阳性对照AG。以上结果表明SP提升了糖基化-Lg中自由氨基和巯基含量，阻止了-Lg与MGO的糖基化反应，减缓了糖基化反应的进程。5.2 表面疏水性
ANS作为一种疏水性探针，可结合到蛋白质表面的疏水区域，当蛋白质被糖基化后，其表面的疏水性会发生一定程度的变化。此外，蛋白质的疏水氨基酸残基也会和多酚的非极性芳香环发生相互作用形成非共价化合物，进而影响两者的结构和功能。在此探讨3 种不同浓度的SP对糖基化
-Lg表面疏水性的影响。由图6可知，与天然的-Lg相比，糖基化-Lg的表面疏水性降低，可能是由于-Lg在糖基化过程中蛋白结构发生折叠，然后通过疏水相互作用聚集，使其表面疏水性降低，又或者是因为糖基化过程中MGO或形成的聚集体占据了-Lg的赖氨酸/精氨酸位点，阻断了疏水氨基酸和ANS疏水探针间的连接。随着SP浓度的增加，糖基化-Lg的疏水性持续降低，这可能是因为SP与-Lg相互作用，导致-Lg发生解折叠，导致蛋白质内部的疏水氨基酸残基暴露到溶液中，所以在一定程度上降低了SP--Lg复合物的疏水性。多酚与蛋白质的结合可以使蛋白质的表面疏水性降低，进而使溶解性增加，这在许多研究中已被证实。Wang Dan等的研究表明紫苏籽蛋白与多酚的相互作用使蛋白质内部的Trp残基暴露到溶液中，因此降低了蛋白质-多酚共价复合物的疏水性，提高了其溶解性。Dai Shicheng等的研究也表明大豆蛋白与儿茶素之间会发生疏水相互作用，导致大豆蛋白聚集，进而抑制二者内部疏水基团间的相互作用，降低其表面疏水性，增加溶解性。5.3 FTIR分析
目前，FTIR是对蛋白质二级结构进行研究的最常用方法。蛋白质和多酚分子的相互作用可以用FTIR进行初步研究。1 600～1 700 cm－1处的酰胺I带和1 500～1 600 cm－1处的酰胺II带作为蛋白质的典型峰，代表C—N的拉伸振动和N—H的弯曲振动。通常，酰胺I带对蛋白质二级结构的改变比酰胺II带更为敏感，因此酰胺I带常被用来解析蛋白质的二级结构。在FTIR光谱中（图7），SP处理过的
-Lg的键位变化很小，但峰的强度改变了很多。结果表明，SP诱导了其二级结构，与-Lg形成络合物。与天然-Lg相比，-Lg-MGO的吸收峰增加，这与酰胺I的N—H弯曲和C—N拉伸有关。然而，SP处理的-Lg完全逆转了这种转变，表明其对-Lg二级结构和相关生物学功能有保护作用。相反，酰胺II带的峰变化不明显。此外，所有样品中在3 400 cm －1 附近出现与O—H拉伸振动相对应的吸收峰，表明各组样品中均存在氢键。与-Lg相比，-Lg-MGO在3 400 cm －1 附近的吸收峰显著增加，可能由于糖基化反应使-Lg与MGO发生相互作用，引入羟基导致O—H伸缩振动增强，加入SP后逆转了这种变化，表明SP阻止了-Lg与MGO的糖基化反应，这与酰胺I带处分析的结果一致。5.4 SP对淀粉样结构的影响
天然
-Lg主要通过范德华相互作用、氢键和疏水相互作用维持蛋白质的结构和功能。-Lg-MGO由于糖基化而产生额外的共价键，它引入了新的分子间力，如席夫碱相互作用和交联。这些额外的力改变了蛋白质的构象、稳定性和反应性。淀粉样原纤维是错误折叠蛋白的聚集体，与多种疾病有关。ThT是一种通常用于检测和研究淀粉样蛋白聚集体的荧光染料，它特异性地结合在淀粉样蛋白原纤维的交叉片核心上。如图8所示，与天然-Lg相比，MGO糖基化后的-Lg具有更高的荧光强度和更多更大的亮斑，被认为是典型的淀粉样蛋白结构。而随着SP浓度的逐渐增大，视场内的亮绿点逐渐减少。在添加160 μmol/L SP的糖基化样品中只观察到几个微弱的绿点，AG干预后样品的绿色淀粉样结构也明显减少，说明有一定的抑制作用。结果表明，SP对-Lg中淀粉样蛋白结构的形成具有抑制作用，其潜在机制可能是SP与-Lg的天然和部分展开的构象有很强的亲和力，有助于氢键和疏水相互作用。多酚在靶向蛋白淀粉样结构的形成方面具有优势，其对淀粉样蛋白纤维的抑制作用被认为是防止糖基化和进一步蛋白质损伤的关键方法。因此，进一步阐明这些多酚分子与蛋白质相互作用的机制很重要。5.5 SP处理对糖基化β-Lg分子质量和聚集的影响
在非酶糖基化反应过程中，AGEs可以与相邻蛋白交联，形成分子质量更高的聚合物。如图9所示，天然的
-Lg（通道2）在15 kDa和35 kDa附近分别显示出一条深蓝色的宽条带和一条浅蓝色的窄条带，反映了-Lg的单体和二聚体形式。-Lg-MGO（通道3）在35 kDa附近的条带变深，表明糖基化促进了-Lg的进一步交联和二聚体的形成。当-Lg在SP或AG存在下糖基化时（通道4～7），约35 kDa处的条带变得较轻。由此可见，SP和AG保护了糖基化-Lg的二级结构，有效抑制了-Lg-MGO的交联，导致AGEs的形成减少。5.6 内源荧光光谱
-Lg的内源荧光主要来自于Trp和Tyr残基，其中Trp的荧光强度最大。-Lg有2 个Trp残基，分别是Trp19和Trp61（图10A），它们位于不同的环境中。Trp19位于蛋白核心（疏水区）内，在结合袋的底部，Trp61在-Lg的外表面。如图10B所示，糖基化和SP处理都能猝灭-Lg在激发波长280 nm处的内源荧光强度，并且随着SP浓度的增加，荧光强度逐渐下降，引起这种现象的原因可能是由于糖基化和SP诱导后的-Lg发生了去折叠，降低了Trp残基之间的能量，导致-Lg分子疏水腔内的Trp19外翻至分子表面，且随着SP浓度的不断增加，Trp19和Trp61逐渐暴露于溶剂中，随后SP与-Lg发生了结合，使得-Lg的内源荧光发生了猝灭。这进一步证实了SP和糖基化处理改变了-Lg的二级结构，这在后面的同步荧光光谱实验中得到了验证。5.7 同步荧光光谱
同步荧光光谱是一种广泛应用于检测蛋白质中主要荧光发色团的技术，包括苯丙氨酸、Tyr和Trp。当激发波长为280 nm时，Trp对荧光强度的贡献最大，其次是Tyr。因此，研究SP对
-Lg荧光氨基酸残基附近微环境变化的影响。Δ＝15 nm和60 nm处最大荧光发射光谱的变化分别反映了Tyr和Trp的变化。如图11所示，随着SP浓度的增加，Tyr和Trp残基的最大荧光强度显著降低，表明SP可以与-Lg形成稳定的配合物，从而猝灭-Lg的Tyr和Trp残基荧光。SP对Tyr的荧光猝灭作用明显高于Trp，表明Tyr是SP对-Lg荧光猝灭作用的主要原因，而Tyr和Trp的最大发射波长变化不明显，综合以上结果表明Tyr比Trp对周围极性的变化更敏感。5.8 SP对糖基化β-Lg三维荧光特性的影响
三维荧光技术可以用于蛋白质空间结构变化研究，主要是由于其激发波长、发射波长和荧光强度与蛋白质微环境的变化息息相关。因此，为了探究SP对
-Lg展开作用的影响以及后期糖基化产物的结构变化，通过三维荧光光谱揭示不同SP浓度下-Lg的结构变化以及糖基化后-Lg的构象变化（图12），在图12A 1 ～F 1 中可以观察到2 个峰，其中峰a（Em ＝Ex ）是典型的瑞利散射峰，峰b（Em ＝2Ex ）是-Lg光谱特征峰的二阶散射。结果显示，SP介导的糖基化-Lg荧光谱中的峰b较天然-Lg和糖基化-Lg都明显降低，表明荧光团官能团的微环境发生了变化。从相应的等高线谱图（图12A 2 ～F 2 ）可以看出，SP介导的糖基化-Lg的等高线变窄且变浅，这也表明SP与-Lg之间存在较强的相互作用，反映了蛋白质中多肽骨架结构变化的结合行为。因此，SP影响了荧光团的微环境，展开了多肽链。据报道，这些变化代表了Tyr和Trp残基的高激发态发出的荧光行为，表明SP也能改变Tyr和Trp残基的微环境，这与内源荧光和同步荧光的结果一致。06
结论
本实验系统地研究了SP的抗糖基化活性。通过体外MGO糖基化
-Lg系统、紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、FTIR、ThT染色、SDS-PAGE、蛋白质氧化产物、表面疏水性、自由氨基和巯基，揭示了其潜在的机制（图13）。结果表明，不同浓度的SP对非酶糖基化产物均有抑制作用。在160 μmol/L条件下，SP的抑制作用较好，此外，它们还可以保护-Lg的二级结构，减少交联结构的形成与β淀粉样蛋白沉积，从而阻止高分子质量AGEs的形成。SP通过疏水和氢键相互作用占据了-Lg的糖基化Tyr和Trp位点，从而增加了-Lg与MGO和微环境的位阻。由于抗糖基化剂的应用可以扩展到许多方面，所以SP是奶茶、面包、烧烤、饼干等含有大量AGEs的过度加工食品中很有前途的抗糖基化剂。目前，抗糖基化和抗衰老的概念已被引入化妆品和保健膳食补充剂的开发。综上，SP可作为一种优良的抗糖基化剂应用于食品和制药行业。作者简介
通信作者：
张彦青 教授
天津商业大学教授，兼任天津市食品学会理事、天津市微量元素学会理事及微量元素分析检测专业委员会主任委员。1999年7月毕业于山东大学药学院，2002年7月于沈阳药科大学获药剂学硕士学位，2009年7月于北京大学获药剂学博士学位，2016年美国克利夫兰州立大学访问学者。
研究方向：（1）食品与药品组分结构、营养功能与作用机制研究；（2）农产品高值化综合利用与基于药食同源物质的新型食品药品健康产品研发；（3）基于高效定性和定量分析方法的健康产品体内外质量评价与代谢动力学研究。
获得荣誉：1. 天津市"131"创新型人才培养工程第一层次人选；2. 天津市高等学校学科领军人才；3. 第十五届天津青年科技奖获得者；4. 2019年天津市优秀科技工作者；5. 2019年天津市最美女教师；6. 中国共产党天津市第十一次代表大会代表；7. 天津市妇女第十四次代表大会代表；8. 天津商业大学优秀教师；9. 天津商业大学优秀共产党员。
第一作者：
王朔 硕士研究生
就读于天津商业大学生物技术与食品科学学院，研究方向：药食同源物质研究与开发。
本文《斯皮诺素对
-乳球蛋白糖基化的缓解作用及机制》来源于《食品科学》2025年46卷第11期29-39页，作者： 王朔，张彦青*，解军波*。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20241205-036。点击下方 阅读原文即可查看文章相关信息。实习编辑：普怡然；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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