糖尿病脑病（DE）是由糖尿病引起的认知功能障碍，并伴有大脑结构及神经生理的改变，包括大脑皮质萎缩、神经元死亡和突触可塑性降低等，是糖尿病危害较为严重的慢性并发症。

桑叶作为国家卫生部首批认定的食药同源植物，自古用于“消渴病”的治疗。团队前期研究已证实，桑叶多组分（主要组分为黄酮）通过调控磷脂酰肌醇3-激酶（ PI3K）/蛋白激酶B（AKT）胰岛素信号通路，减轻2型糖尿病大鼠氧化与炎症损伤，改善胰岛素抵抗，发挥降血糖功效。

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化的细胞株，其形态、生理、生化及功能方面接近于神经元，且PC12细胞更易获得与培养，常选择PC12细胞作为DE细胞模型。网络药理学通过构建和分析“疾病-基因-靶点药物”相互作用网络，系统、综合观察药物对疾病网络的干预与影响，有助于阐明药物多组分、多靶点和多途径协同作用机制，促进新药物的开发利用。

成都医学院检验医学院的许涵、李梁、柴涛、江岩*等通过高糖刺激PC12细胞建立DE细胞模型，探讨桑叶黄酮提取物（MFE）对DE细胞模型的保护作用；将网络药理学与分子生物学手段相结合，探讨MFE对DE细胞模型的作用机制。研究结果将推动以桑叶为代表的食药两用资源在DE 治疗方面的深度开发利用，造福广大老年DE患者，具有一定的理论价值和重要的现实意义。

1 细胞实验结果

1.1 DE细胞模型的建立

如图1所示，当葡萄糖溶液浓度达225 mmol/L时， PC12细胞存活率显著降低至47.95%（

P
＜0.05），低于50%。因此，确定建立DE细胞模型的条件为225 mmol/L葡萄糖作用24 h。

1.2 MFE干预质量浓度的确定

如图2A、B所示，与正常对照组相比，无论干预24 或48 h，MFE在20～320 μg/mL质量浓度范围内对PC12细胞存活率均无显著影响，说明在此范围内并未表现出毒性作用。分别选择质量浓度40、160 μg/mL MFE作为低剂量和高剂量，作用48 h，进行后续实验。

1.3 MFE对DE细胞存活率、LDH活力及AGEs含量的影响

如图2C所示，相较于正常对照组，模型组细胞存活率显著降低（

P
＜0.05）且低于50%，表明已成功建立DE细胞模型。与模型组相比，MFE低、高剂量组细胞存活率显著提高（
P
＜0.05），分别是模型组的1.65、 1.87 倍，与阳性对照组接近，表明MFE能够显著改善DE 细胞的存活率。如图2D所示，相较于正常对照组，模型组DE细胞LDH活力显著提高（
P
＜0.05），表明细胞受损明显；而MFE干预后，低、高剂量组的LDH活力显著下降为模型组的80.00%、77.78%（
P
＜0.05），与细胞活力实验结果一致。如图2E所示，相较于正常对照组，模型组中DE细胞内AGEs含量显著增加（
P
＜0.05）。MFE 干预后AGEs含量显著降低（
P
＜0.05），低、高剂量组 AGEs含量分别为模型组的78.15%、64.18%，表明MFE通过减少高糖诱导的AGEs积累有效保护DE细胞。

如图2F所示，显微镜下观察到正常对照组细胞有多个突起，突触较长，类似神经元轴突。细胞排列紧密，边缘清晰，密度大。经慢性高糖刺激后，DE细胞间隙变大，突触减少。细胞折光性差，边缘不清晰，单个细胞内存在空泡。DE细胞经MFE干预后，细胞形态与数量均呈现出积极的转变趋势，以高剂量组细胞状态最佳。

1.4 MFE对DE细胞铁死亡相关指标的影响

如图3所示，与正常对照组相比，模型组细胞内SOD 活力与GSH含量显著降低，而MDA、Fe2＋含量显著增加（

P
＜0.05），表明慢性高糖造成DE细胞内氧化损伤的同时，引起细胞内铁超载。MFE干预则逆转了DE细胞的氧化损伤，MFEH组SOD活力、GSH含量显著提高 （
P
＜0.05），分别为模型组的1.95、2.47 倍，MDA 含量与 Fe2＋含量显著下降至模型组的38.07%、34.39% （
P
＜0.05），表明MFE可有效减轻DE细胞因高糖刺激引发的氧化应激损伤及铁超载，从而保护DE细胞。ROS检测结果（图3E）也证实了这一结论，模型组细胞内荧光强度增强，ROS含量增加，峰右移。经MFE干预后细胞内荧光强度降低，峰左移，ROS含量降低，明显低于模型组。

1.5 MFE对DE细胞凋亡的影响

如图4所示，与正常对照组相比，模型组的细胞凋亡率显著上升（

P
＜0.05），表明高糖环境会诱导DE细胞凋亡。与模型组相比，MFE干预后细胞凋亡被逆转，低、高剂量组细胞凋亡率分别显著下降为模型组的69.54%、 57.66%（
P
＜0.05）。

2 网络药理学分析结果

2.1 潜在靶点筛选与PPI网络构建

通过数据库检索、筛选获得233 个药物作用靶点和 828 个疾病作用靶点。如图5A所示，获得交集靶点共 99 个，作为桑叶治疗DE的潜在靶点。PPI网络的构建及分析发现，Degree值排名靠前的关键靶点分别为TNF、胰岛素（INS）、IL-6、白蛋白（ALB）、AKT1、IL-1β（图5B）。

2.2 KEGG分析

如图6所示，KEGG富集的通路中与本研究相关程度较高的通路包括糖尿病并发症AGEs-AGEs受体（RAGE）、MAPK、 TNF信号通路等。

2.3 药物-成分-靶点-疾病的网络分析

如图7所示，绿色节点为桑叶；红色节点为DE； 21 个蓝色节点为活性成分；20 个紫色节点为通路；99 个黄色节点为靶点。分析网络图可知，Degree值排名靠前的活性成分主要为槲皮素、

-胡萝卜素、花生四烯酸、鸡血藤酸酯、桑辛素D；潜在靶点中MAPK14、AKT1、 TNF、MAPK1、MAPK8连接较多边数；通路中如流体剪切力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症AGEs-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化、MAPK、TNF信号通路与潜在靶点有较多关联。

2.4 分子对接

分析药物-成分-靶点-疾病通路网络图中成分与靶点连接的Degree值，结合课题组前期实验结果，将桑叶黄酮组分中的槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷、芦丁、绿原酸与Degree值排名前5的潜在靶点MAPK14、AKT1、 TNF、MAPK1、MAPK8进行分子对接分析，所有组合的对接结合能均小于－20.92 kJ/mol，结合稳定。图8为槲皮素与AKT1、异槲皮苷与TNF、紫云英苷与MAPK1、芦丁与MAPK14、绿原酸与MAPK8分子对接的可视化结果，结合能分别为－41.00、－39.33、－35.56、 －33.47、－26.36 kJ/mol。

2.5 关键靶点的WB检测结果

结合网络药理学靶点预测，对DE细胞信号通路关键靶点的蛋白表达进行检测。如图9A所示，与正常对照组相比，模型组PI3K、AKT蛋白表达水平均显著降低 （

P
＜0.05），表明DE细胞内PI3K/AKT胰岛素信号通路受到抑制。如图9B所示，高糖抑制铁死亡调控轴关键蛋白Nrf2、GPX4表达，而MFE干预后，PI3K、 AKT、Nrf2及GPX4均被激活，蛋白表达水平显著提高 （
P
＜0.05），分别为模型组的1.37、1.61、1.55、 1.68 倍，表明DE细胞内受损的胰岛素信号通路及铁死亡情况均有明显改善。

如图9C、D所示，相较于正常对照组，模型组炎症信号通路NF-κB、炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及凋亡相关通路MAPK14、Caspase-3均被激活（

P
＜0.05）。与模型组相比，MFEH组NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平显著降低（
P
＜0.05），仅为模型组的71.91%、 76.70%、82.49%、45.65%，表明MFE可能通过抑制炎症通路蛋白NF-κB表达，进而抑制IL-1β等促炎因子表达，改善DE细胞炎症损伤情况。MFEH组MAPK14、 Caspase-3蛋白表达水平显著下调（
P
＜0.05），分别为模型组的62.50%、71.73%，表明MFE可能通过抑制 MAPK14及其下游促凋亡基因
Caspase-3
表达降低DE细胞凋亡率，从而保护细胞。

DE具有遗传、环境、内源性因素（脑衰老）等多因素致病性。慢性高糖持续刺激海马神经元，促进线粒体ROS产生，引起海马区蛋白质的非酶糖化和葡萄糖氧化，产生大量AGEs。AGEs与RAGE结合，导致脑内 PI3K/AKT信号级联失活，抑制其下游Nrf2表达，造成氧化应激，导致神经元细胞铁死亡，是糖尿病认知功能障碍发病机制中的关键环节。Nrf2/GPX4轴是调节体内氧化应激损伤和脂质过氧化的重要途径。当机体出现氧化损伤时，Nrf2易位到细胞核，与调控区的抗氧化反应元件结合，促进GSH合成及其下游

GPX4
转录，提高细胞抗氧化能力，抑制铁死亡。

另一方面，AGEs-RAGE信号通路被激活后，可触发 MAPK途径，激活氧化应激敏感因子NF-κB介导炎症反应， 释放IL-1β等促炎因子，改变神经元突触的可塑性。 MAPK通路还会激活促凋亡蛋白Bax启动Caspase依赖途径，诱导神经元细胞凋亡，最终引起认知功能障碍。

本研究采用高糖刺激PC12细胞，体外建立DE细胞模型。MFE的干预对DE细胞模型具有明显的保护作用。采用网络药理学筛选MFE干预DE的潜在靶点与关键信号通路。KEGG富集分析显示，MFE干预DE 的关键信号通路可能为糖尿病并发症AGE-RAGE、 MAPK及TNF信号通路，潜在作用靶点为MAPK14、 AKT1、TNF、MAPK1、MAPK8。将MFE的主要组分槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷、芦丁、绿原酸与上述潜在靶点进行分子对接，所有组合对接结合能均小于 －20.92 kJ/mol，具有较强的对接活性，表明MFE可能通过以上潜在靶点在DE治疗中发挥关键作用。随后采用分子生物学手段验证MFE是否通过调控上述主要通路和关键靶点发挥对DE细胞的保护作用。WB结果显示，DE细胞模型受到高糖刺激时，因AGEs与ROS过度积累，抑制其下游PI3K/AKT/Nrf2/GPX4蛋白表达，细胞氧化应激受损。MFE通过减少AGEs与ROS含量，有效逆转AGEs RAGE通路下游PI3K/AKT/Nrf2/GPX4蛋白表达，提高DE细胞抗氧化酶SOD活力、提高GSH含量、抑制过氧化脂质MDA产生，提高抗氧化能力；此外，MFE明显降低细胞内Fe2＋含量、减轻铁超载，进而抑制DE细胞铁死亡。 WB结果与体外细胞实验结果相印证，与网络药理学预测的AGEs-RAGE信号通路及潜在作用靶点AKT1相对应。

另一方面，WB结果显示，DE细胞内过量的AGEs 激活其下游MAPK14/NF-κB/Caspase-3炎症及促凋亡通路蛋白表达，诱导炎症因子TNF-α等在蛋白水平异常高表达，导致DE细胞炎症损伤及细胞凋亡；而MFE通过减少 AGEs含量，抑制AGEs-RAGE通路下游MAPK14/NF-κB/ Caspase-3通路蛋白表达，降低TNF-α等促炎因子表达，有效逆转细胞的炎症损伤及细胞凋亡，验证了MFE通过调控网络药理学筛选的MAPK、TNF信号通路的关键作用靶点MAPK14、TNF发挥抗DE作用这一结论。

大量研究证实黄酮类化合物通过抗炎、抗氧化、抑制铁死亡与细胞凋亡等多个环节保护神经元细胞、改善认知功能障碍。红景天苷、白花前胡丙素通过激活PI3K/ AKT信号通路，减少糖尿病小鼠海马神经元氧化应激，改善小鼠学习记忆能力。雏菊黄酮通过上调PI3K/AKT 信号通路，抑制促凋亡基因

Caspase-3
表达，减少脑缺血大鼠的神经损伤。绿原酸能够保 护β-淀粉样蛋白 1-42 寡聚体处理的小鼠海马神经元细胞，圣草酚能够保护双转基因阿尔茨海默病模型小鼠，通过激活Nrf2信号通路，减轻铁超载，抑制铁死亡，发挥抗阿尔茨海默病作用。银杏二萜内酯、杜仲木脂素通过抑制TNF-α等炎症因子的转录水平抑制DE大鼠海马神经元炎症反应，改善认知功能障碍。槲皮素通过下调IL-β的表达抑制炎症损伤和神经退行性变，改善DE模型小鼠的认知功能障碍。上述研究结果与本研究结果较为一致。

结 论

总而言之，MFE通过减轻DE细胞内AGEs积累激活 PI3K/AKT/Nrf2/GPX4信号通路、减轻氧化应激损伤，从而抑制铁死亡；抑制MAPK14/NF-κB/Caspase-3炎症及促凋亡通路，减轻炎症损伤、抑制细胞凋亡；MFE通过多途径、多靶点发挥对高糖所致PC12细胞损伤的保护作用。WB结果验证了网络药理学筛选关键靶点与信号通路的可靠性，提示网络药理学在食药同源植物资源干预糖尿病认知功能障碍等糖尿病并发症研究中能够提供有力的生物信息学依据。本研究结果为后期通过体内实验深入探讨MFE干预DE的作用及其机制提供科学依据，拓宽食药两用植物桑叶在DE等并发症中的应用前景。

通信作者：

江岩 教授

成都医学院检验医学院食品营养教研室 主任

毕业于四川大学华西医学中心营养与食品卫生学专业；医学博士；硕士生导师；国家注册营养师。四川省第十二批学术技术带头人后备人选。研究方向为营养与慢性疾病、功能性食品研发。主持国家自然科学基金等各类项目20余项，在《Food Chemistry》等期刊发表SCI收录论文10余篇。

第一作者：

许涵 硕士研究生

成都医学院检验医学院 医学技术（临床营养方向）研究生

本科毕业于成都医学院检验医学院食品质量与安全专业，获2024届四川省优秀大学毕业生、“建行杯”四川省国际大学生创新大赛（2023）铜奖、第十七届“挑战杯”四川省大学生课外学科技术作品竞赛三等奖。研究方向为食品营养与慢病。在《Journal of Ethnopharmacology》期刊发表SCI论文1 篇。

本文《基于网络药理学探讨桑叶黄酮提取物对糖尿病脑病细胞模型保护作用机制》来源于《食品科学》2025年46卷第10期167-177页，作者：许 涵，李 梁，柴 涛，杜洪燕，李学理，江 岩*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240814-106。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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