用PCR法从鱼池淤泥中检测到病毒能说明什么？▏陈昌福专栏

文/华中农业大学陈昌福，武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军

正文/5461字

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陈昌福有话说

最近一段时间，也许是因为我们关于在对虾等水产养殖动物饲料中检测到某些致病性病毒和寄生虫基因片段的问题，发表了我们相关意见的缘故，有一些水产养殖业者来信息咨询问题，在池塘淤泥中检测到致病性病毒和寄生虫的基因，是不是也没有问题？

因为这种疑问可能对于更多的水产养殖业者都是存在的。我们在撰写的这篇小文章中，介绍了PCR检测致病性生物的基本原理、方法以及所检测目标物质的基础上，回答了从池塘淤泥中检测到致病性病毒和寄生虫的基因后，尚需要采用实验证明这些致病性病毒和寄生虫是否活体，如果实验结果证明不是活体的话，就是属于已经失去了致病作用的遗传物质。希望对广大水产养殖业者提高对这类问题的认知水平有所帮助。

用PCR法从鱼池淤泥中

检测到病毒能说明什么？

摘要：本文介在绍了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法检测致病性生物的基本原理、方法以及所检测目标物质的基础上，回答了来自水产养殖业者询问的从池塘淤泥中检测到致病性病毒和寄生虫的基因后，因为从池塘淤泥中检测到的只是致病性病毒和寄生虫的基因，还需要采用先相关实验证明这些致病性病毒和寄生虫是否活体？如果实验结果证明不是活着的致病性病毒和寄生虫的话，就是属于已经失去了致病作用的遗传物质，而仅有遗传物质是没有致病功能的。

关键词：聚合酶链式反应；鱼池淤泥；致病性生物；遗传物质；致病功能

与陆生养殖动物相比，水产养殖动、植物的疾病，存在着病原种类众多、传播速度快、疾病危害大、特效药物少、有效治疗难的特点。尤其是由致病性细菌与病毒等微生物引起的传染性疾病，其疾病的发生与流行大都具有暴发性，有效控制疾病就显得尤其困难。因此，对于水产养殖动物的各种疾病，长期以来我国坚持实施的防控方针就是“以防为主，防重于治”。

为了有效地防控水产养殖动、植物的疾病，实施对能危害水产养殖动物的致病性生物的监测，已经是由国内、外的大量实践结果证实，是防止水产养殖动物致病性生物扩散的重要措施，也是我国农业农村部多年来，一直在支持全国水产科研与技术推广单位，坚持推进的一项重要防控水产养殖动物疾病的举措。在全国水产技术推广总站带领下，每年对于严重危害水产养殖动物的病毒性疾病，譬如主要危害草鱼（

Ctenopharyngodon idella

Cyprinus carpio

Macrobrachium rosenbergii

对水产养殖动、植物致病性生物的检测方法，最好是能具有检测结果准确、对痕量样品灵敏、技术操作简单、所需时间快捷的特点。为了寻求能达成这些目标的检测方法，国内外科学工作者做出了长久的努力，直至聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法的开发成功，才堪称是真正拥有了能准确、灵敏、简单和快捷的检测方法。

1.用PCR检测致病性生物的原理与方法

自从1953年，由詹姆斯·沃森（James Watson）和弗朗西斯·克里克（Francis Crick）提出DNA的双螺旋结构模型，解释了遗传信息的存储与传递机制。随后，全世界的生物科学家利用生物遗传信息物质开展了生物育种学、医学及其生物学相关的大量基础与应用研究。PCR方法就是针对各种生物具有特征性遗传信息物质，建立起来的实验方法。

PCR通过扩增致病性生物DNA/RNA，可以实现检测结果准确、对痕量样品灵敏、技术操作简单、所需时间短暂的特点。PCR能够检测极低浓度的DNA或RNA，甚至少至几个分子，因此，PCR具有极高的灵敏度。通过设计特异性引物，PCR可以精准扩增目标序列，避免非特异性产物，因而具有极高的特异性。PCR反应通常在数小时内即可完成，特别适合需要快速得到检测结果的样品，因而具有需要时间短、快速获得结果的特点。PCR技术相对简单，实验步骤易于被操作者熟练掌握，因此具有操作简单的特点。总之，PCR可用于基因克隆、突变检测、病原体检测、遗传病诊断等生物学相关的多个领域，因此具有应用面广的特点。

PCR法检测致病性生物的原理是，基于DNA的扩增和特异性识别，基本步骤如下。

首先，从待检测样品中提取病原体的DNA，作为扩增的模板（template）。

其次，根据目标致病性生物的特定基因序列设计引物（primer），确保特异性。

其三，加热使目标中并行生物的DNA双链分离，此过程称为变性。

其四，降温使引物与目标DNA序列结合，此过程称为退火。

其五，DNA聚合酶以引物为起点，合成新的DNA链，此过程称为延伸。

其六，重复变性、退火、延伸步骤，目标DNA片段呈指数增长。此过程为循环扩增。

最后，通过凝胶电泳、荧光标记等方法检测扩增产物。根据扩增产物的大小或荧光信号判断样本中是否含有目标病原体。

PCR法现已广泛地应用于危害水产养殖动物的致病性病毒、细菌、真菌等病原生物的检测，如对虾白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）、对虾肠肝胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）等。

2.检测样品要求与PCR检测结果的判断

采用PCR法检测致病性生物并判断其是否具有传染性的时候，对于检测样品是具有明确要求的。在世界动物卫生组织（office international des epizooties，OIE）牵头制定的《水生动物卫生法典》2012（第15版）一书中，譬如关于检测WSSV对样品的规定中，第9.6.3条的内容是这样的：从尚未宣布是无WSSVD的国家、地区或生物安全隔离区进口或运输水生动物及其相关制品时，规定如下。

1.授权以下符合第5.3.1条之标准、第9.6.2条所涉及的水生动物及其相关制品的进口或运输时，不管输出国、地区或生物安全隔离区的WSSVD状况如何，输入国官方机构不应要求出口国、地区或生物安全隔离区出示任何与WSSVD相关的说明。

a．经高温灭菌并密封保存的甲壳动物制品（是指121℃高温灭菌3.6min以上或可灭活WSSV的其他温度和处理时间）。

b．经60℃热处理1min以上的烹制甲壳动物制品（或可灭活WSSV的其他温度和处理时间）。

c．经90℃热处理10min以上的巴氏灭菌的甲壳动物制品（或可灭活WSSV的其他温度和处理时间）。

d．甲壳动物油。

e．甲壳动物粉。

f．化学提取的甲壳素。

这些规定的内容是非常明确的，只要是按照一定要求加工过的物质，就不需要检验其中是否带有WSSV了（也适用于其他致病性生物），不论是来自疫区还是无病区的物质，都可以按照这个原则堆到检测样品。

OIE之所以规定上述样品不宜用于检测致病性生物，就是因为采用PCR检测致病性生物时，是提取致病性生物的DNA制作扩增的模板，并根据目标致病性生物的特定基因序列设计的引物，检测样品种只要是存在特定基因序列片段，就可以被采用的PCR方法检测到。无论供做PCR法检测的样品中是否存在活着的致病性生物，只要样品中尚存在致病性生物的遗传物质就可以被检测到，因为PCR法检测的是样品中存在的DNA遗传物质。

在我国一些水产养殖区域，部分水产养殖业者为了防控水产养殖动物疾病，将养殖池塘淤泥作为检测样品，结果PCR法从不少养殖池塘淤泥中，均检测到了能危害水产养殖动物致病性生物所特有的DNA遗传物质，而且即使经过较长的时间內的反复检测，都能检测到阳性结果。正是因为总是在能检测中能获得阳性结果，导致有些水产养殖业者长期不敢向养殖池塘中放养水产养殖动、植物种苗，而耽误了水产养殖生产季节。

利用PCR法之所以能从养殖池塘淤泥中检测到某种致病性生物的DNA遗传物质，可能是因为在前面的养殖生产中，曾经发生过由这种致病性生物引起的疾病或者是因为养殖动、植物曾经携带过这种致病性生物的缘故。最后因为感染致病性生物而死亡的水产养殖动、植物沉积在池塘淤泥中，就会留下这种致病性生物的DNA遗传物质。

因此，由PCR法从池塘淤泥中检测到某种致病性生物的DNA遗传物质后，为了要证明这种致病性生物是否具有传染疾病的功能，就需要采用相应的实验方法证明这种致病性病原生物是活着的？否则，用PCR法检测到的阳性结果就是属于某种致病性生物的DNA遗传物质，是没有传染疾病功能的了。

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作者：华中农业大学陈昌福；武汉科研时代生物技术有限公司周鑫军。

编辑：郑燕云

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