呼吸道黏膜型 mRNA疫苗 前景广阔但研发困难，其效能取决于m RNA 翻译效率与稳定性 。 m RNA分子需克服肺组织 特殊 的生理环境和免疫网络 监控 才能触发强效保护【1】。除了 优化 递送系统 克服 上述屏障的策略之外， m RNA分子自身性质 同样 至关重要但易被忽略 。例如，已 上市mRNA疫苗（如BNT-162b2）均 基于 肌肉注射途径设计，其 m RNA序列设计在呼吸道环境 的 表现不佳 ， 这提示肺组织可能需要 定制化 的序列设计。 此外，尽管已有报道提示 体外转录产生的双链RNA（dsRNA）污染物会激活 先天 免疫通路，抑制注射途径 m RNA抗原表达【2】， 但其 对粘膜mRNA疫苗的 影响与机制尚未明确 。
近日，来自 第三 军医大学 / 慕尼黑大学的关山团队在Molecular Therapy上发表 了题为Airway-applied mRNA vaccine needs tailored sequence design and high standard purification that removes devastating dsRNA contaminant的研究 ，阐明dsRNA在呼吸道极易激活TLR3/RIG-I等先天免疫受体触发OAS-RNase L介导的mRNA降解机制，揭示了呼吸道接种对mRNA分子的质量要求相较于肌注途径更为严苛。为此，团队提出了肺组织特异性mRNA序列优化 + 新型纯化技术的双重解决方案：使抗原表达提升30倍以上，并显著增强 黏膜免疫为主、体液免疫和细胞免疫并举的适应性 免疫应答。而 肌肉注射同等剂量对照m RNA疫苗却 未呈现显著优势，该研究从优化 mRNA 分子 这一被长期忽视但至关重要的 视角 为黏膜mRNA 疫苗 的发展提供了新的 思路 。
研究团队通过对比肌肉注射（i.m.）与呼吸道吸入（i.h.）途径 的mRNA表达以及免疫效力差异 ， 阐明了体外转录过程中引入的 dsRNA 杂质 会显著影响 i .h.途径接种的 m RNA生物学效应。当引入仅1% （w/w） dsRNA 杂质 时，i.h.组的 m RNA蛋白表达 降低 98.8%，而i.m.组 则仅 下降63%。这种悬殊差异源于肺组织密集的免疫监控网络 ， dsRNA 极易 激活呼吸道内的TLR3/RIG-I/MDA-5受体 及 OAS-RNase L介导的mRNA降解级联反应，诱导IFN-α/β等炎症因子 上升，最终 清除进入呼吸道的 m RNA疫苗。为攻克 此 难题 ， 团队基于Oligo-dT18亲和层析技术开发了全新的 mRNA纯化方法 。该技术通过四步缓冲体系实现精准纯化：高盐环境捕获带polyA尾的mRNA→磷酸盐缓冲液高效洗脱dsRNA等杂质→无核酸酶水解离目标分子→NaOH再生色谱柱。实验 结果 显示：>99.5% dsRNA被清除（dot blot检测），电泳显示mRNA完整性 良 好。
为解决 已上市mRNA 疫苗序列设计（如BNT-162b2的α-珠蛋白来源序列）在呼吸道 不匹配 的问题（本研究主要关注非编码区 U TR序列），团队基于人类蛋白质图谱（HPA）的肺部单细胞数据，筛选出10个保守 的 高表达基因。其中 ，相较于α-globin的UTR组合， TMSB10的UTR组合表现出色， 可 使肺部支气管上皮细胞和树突细胞的蛋白表达 显著提升 。通过进一步 人工 改造优化 —— 删除3'UTR内mi cro R NA 结合位点；在5'UTR插入Apt-eIF4G增强翻译起始效率；3'UTR引入R3U稳定元件 —— 最终获得的"TB-Opti"序列 。经小鼠活体验证，优化后的 mRNA在肺 部 的表达量较 已 上市疫苗采用的序列设计策略提升10倍，成功突破呼吸道部位 m RNA序列适配性瓶颈。
采用"TB-Opti序列+亲和纯化"双重策略 优化的m RNA疫苗，展现出惊人的增效作用：肺组织抗原表达 提 升30倍，血清IgG抗体和支气管肺泡灌洗液中的sIgA抗体同步提升 约 4倍。尤其值得注意的是，肺组织驻留记忆性CD8 ⁺ T细胞（Trm） 比例扩增 68倍，中和抗体效价高达1/50,000。而相同优化在肌肉注射中仅使抗原表达提升3倍，且 未能 诱导黏膜sIgA和Trm细胞，凸显呼吸道接种对mRNA分子自身质量的独特高要求。
本研究开创性地从 mRNA分子质量维度揭示呼吸道黏膜疫苗的效力瓶颈，确立"序列设计-纯度控制"双重优化范式。该发现不仅有望重塑领域对黏膜 m RNA疫苗研发瓶颈的认知框架，更为抗呼吸道病原体的mRNA疫苗设计提供了源头性创新策略。
第三 军医大学张 靖靖 、李超、刘宇恒为共同第一作者，关山、丁 晓 燕、裴 叔宸 为通讯作者。研究获得 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 提供的 d sRNA标准品支持。
原文链接
https://doi.10.1016/j.ymthe.2025.05.024
制版人：十一
参考文献
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[2] Lenk, R., Kleindienst, W., Szabó, G.T, Baiersdörfer, M., Boros, G., Keller, J.M.Mahiny, A.J., and Vlatkovic, I. (2024). Understanding the impact of in vitro tran-scription byproducts and contaminants.Front. Mol. Biosci.11, 1426129. https://doi.org/10.3389/fmolb.2024.1426129.
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