镉（Cd），一种具有高毒性的重金属，是危害公众健康最常见的环境持久性污染物之一。土壤Cd可通过存在形态、作物吸收等方式迁移转化至作物中，在农作物中积累，并通过食物链危害人类健康。

天然多糖属于一类天然高分子化合物，它们遍布于植物、真菌和藻类之中，具有多样的生物活性，包括抗氧化、抗肿瘤、降低血糖和调节免疫等功效，且能显著减轻或抑制肾脏疾病的进展。研究显示，多糖可通过减少组织中Cd的累积，减轻Cd诱导的氧化应激、脏器纤维化及线粒体功能障碍，而作为Cd诱导生物毒性的解毒剂。黑灵芝（Ganoderma atrum）作为贵州省食用菌产业中的一种重要食用菌，富含多糖、三萜、甘露醇和氨基酸等多种生物活性成分，具有显著的药食两用潜力。其中多糖是黑灵芝中主要的活性成分之一。课题组前期研究发现，黑灵芝多糖（GAP）对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基、羟自由基具有较好的清除能力，表明其具有潜在的良好抗氧化能力，但GAP对Cd致人胚胎肾细胞损伤的保护作用尚不明确。

因此，贵州医科大学公共卫生与健康学院的王林春、唐丹丹、张清海*等人建立GAP干预Cd染毒HEK-293细胞模型，从细胞形态、氧化还原状态及线粒体自噬等途径探讨GAP对Cd染毒细胞的保护作用，评估GAP抑制Cd诱导肾毒性的可能潜力，以期为探索黑灵芝作为有效膳食干预及GAP在临床应用提供依据。

1 GAP对Cd暴露致HEK-293细胞活性及形态的影响

细胞活性是反映细胞毒性的重要评价指标。细胞密度达到80%左右后，加入不同质量浓度（10、25、50、100、200 μg/mL）的GAP观察细胞存活率，结果如图1A所示，100、200 μg/mL组的存活率相比于空白组明显升高，因此选取100 μg/mL GAP作为后期干预细胞的质量浓度；在预实验的基础上，经过Cd（2 μg/mL）处理后，细胞达到半致死数量，存活率达到59.7%（图1B），由此选择2 μg/mL Cd构建细胞损伤模型；由图1C可知，经过GAP（100 μg/mL）干预后，细胞存活率显著上升（P＜0.05）。

通过光学显微镜观察细胞形态结构，结果显示（图2），经Cd、GAP处理后的HEK-293细胞形态明显不同。空白组细胞形态均一，典型的上皮细胞形态；而Cd会使细胞密度下降，贴壁性能降低并伴随着形态变圆等现象；经过GAP干预后，细胞密度上升，但细胞形态仍是圆形；单独使用GAP并未改变细胞形态，反而细胞密度明显上升。

2 GAP对Cd暴露致HEK-293细胞LDH释放的影响

LDH活性是反映质膜完整性的标志，也是检测细胞死亡的重要指标。如图3所示，与空白组相比，模型组LDH活性显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，干预组LDH活性显著降低（P＜0.05）。表明Cd暴露导致HEK-293细胞LDH释放，导致细胞膜完整性破坏，造成明显的细胞毒性，而GAP可使细胞减少LDH释放，缓解Cd诱导的细胞毒性。

3 GAP对Cd暴露致HEK-293细胞氧化损伤的影响

3.1 GAP对Cd暴露致HEK-293细胞ROS产生的影响

Cd诱导使机体产生过量ROS，导致机体氧化损伤。由图4可知，Cd作用后细胞ROS水平显著升高（P＜0.05），而GAP干预后，ROS水平降低47.1%（P＜0.05），单独使用GAP不影响细胞ROS的产生。因此，GAP处理能有效抑制Cd引起的ROS水平升高，减轻Cd毒性。

3.2 SOD、GSH、CAT活性和MDA含量变化

由图5可知，相比空白组，Cd处理后GSH、CAT及SOD水平均显著降低（P＜0.05），MDA含量显著上升（P＜0.05）；与模型组相比，干预组GSH、CAT及SOD水平分别上升72.7%、176.8%、76.89%，MDA含量下降48.88%。结果表明，GAP可能通过提升细胞的抗氧化能力及降低MDA含量，减轻Cd暴露导致的氧化应激。

3.3

HO-1
Keap1
Nrf2
mRNA的表达水平变化

如图6所示，HO-1、Nrf2及Keap1 mRNA表达量均受Cd暴露影响，与空白组相比，模型组分别下降了57.6%、55.6%及上升了76.7%；然而与模型组相比，干预组HO-1、Nrf2 mRNA表达量分别上调了84.7%、33.5%，Keap1 mRNA表达量下调了32.8%。由此表明，GAP可能通过调节抗氧化相关基因发挥抗氧化作用，缓解Cd导致的细胞氧化损伤。

4 GAP对Cd诱导细胞超微结构变化的影响

透射电子显微镜结果显示（图7），空白组HEK-293细胞线粒体结构完整，轮廓清晰；相比于空白组，模型组线粒体完整性被破坏，大部分线粒体出现空泡化、线粒体溶解和自噬溶酶体形成等现象；与模型组相比，经过GAP干预后，线粒体空泡化现象减少，部分线粒体结构完整，但仍有自噬溶酶体形成；多糖组细胞线粒体结构清晰，无损伤现象。由此得知，Cd暴露会损伤HEK-293细胞线粒体结构的完整性，而GAP具有缓解Cd引起线粒体损伤的可能性。

5 GAP对Cd暴露致HEK-293细胞线粒体膜电位水平变化的影响

线粒体膜电位即内膜两侧的电势差，可保证线粒体体内各种生理活动正常进行，是反映线粒体功能的重要参数。如图8所示，与空白组相比，Cd暴露可显著降低HEK-293细胞中线粒体膜电位水平（P＜0.05），而与模型组相比，GAP可使膜电位水平恢复至0.81±0.09（P＜0.05）。表明GAP可通过恢复细胞线粒体膜电位水平缓解Cd导致的线粒体功能障碍。

6 GAP对Cd暴露致HEK-293细胞线粒体自噬的影响

检测PINK1、Parkin、P62及LC3 mRNA表达量，结果如图9所示，相比空白组，Cd可使PINK1、Parkin、P62及LC3 mRNA表达量显著上调（P＜0.05）；与模型组相比，经过GAP干预后，线粒体自噬相关基因表达量分别下降35.8%、36.9%、16.70%及18.5%。由此可见，GAP能够抑制线粒体自噬相关基因表达水平上调，缓解Cd引起的线粒体过度自噬。

Cd可通过食物链进入机体并对肾脏等主要靶器官造成损害。Cd致肾脏损伤主要通过引发氧化应激和激活自噬等机制，从而造成严重的肾功能障碍，最终演变为肾衰竭。多糖是一种具有显著疗效且毒副作用低的天然物质，可作为有效食源性干预物质缓解Cd诱导肾脏毒性损伤。研究表明，多糖可减轻Cd导致的细胞活力降低，对HEK-293细胞中Cd诱导的氧化应激具有预防作用。多糖对重金属诱导的肾脏损伤具有明显的干预效果，能够增强细胞内抗氧化系统能力，并抑制细胞死亡过程。在本研究中，经过GAP处理后，细胞活力和抗氧化酶活性升高，对Cd导致的细胞活性降低及氧化应激具有缓解作用。

Cd可干扰氧代谢，导致自由基产生，产生的自由基主要由电子传输链和线粒体膜电位所介导，一旦线粒体膜电位下降，就会改变膜通透性进而增加ROS水平。当机体防御体系受到损害或ROS产生超过机体抗氧化防御体系的清除能力时，自由基可导致细胞氧化应激的发生，导致细胞氧化损伤。氧化应激是Cd诱导机体损伤的主要机制之一。SOD代表抗氧化酶的活性，CAT可保护细胞免受氧化氢的毒性作用，MDA水平是显示脂质过氧化速率增加的重要指标，GSH是低分子质量细胞合成的抗氧化剂。Nrf2和HO-1是在大多数细胞中调节抗氧化防御的主要转录因子，它可以促进GSH、抗氧化酶生成等功能。当机体受到氧化应激时，Nrf2与HO-1被激活，调控大量抗氧化基因产物的表达，Keap1作为负调节因子抑制Nrf2活性，导致氧化应激环境下抗氧化防御能力受损。本研究发现，GAP可降低ROS水平和MDA含量，提高SOD、CAT活力和GSH含量，维持细胞内ROS稳态；能够上调Nrf2、HO-1及下调Keap1基因的表达。Liu Hongshuang等发现慈姑多糖可有效降低细胞中ROS水平，同时也可激活Nrf2信号通路以减轻细胞氧化应激。Wang Jicang等研究表明槲皮素通过激活Nrf2-Keap1通路消除ROS，提高抗氧化酶活性，增加Nrf2或降低Keap1蛋白和基因的表达，由此保护Cd诱导的细胞损伤。本研究结果与上述研究一致，GAP可在细胞受氧化应激下增加抗氧化酶活性及非抗氧化酶含量，表明其可能通过Nrf2信号通路减轻Cd暴露下氧化状态的不平衡。

线粒体功能障碍与氧化应激关系密切，线粒体即是反应性物质的生产者，也是靶标。线粒体不仅是ROS产生的主要场所，同时也是ROS攻击的主要靶点之一。当ROS在细胞中累积会造成蛋白质、脂质和DNA等细胞成分的氧化损伤，进而引发自噬。线粒体自噬是细胞维持线粒体稳态和功能的重要调控机制，其中PINK1/Parkin途径是调控线粒体自噬的经典途径。当线粒体功能受损和膜电位发生变化时，PINK1发生磷酸化并募集Parkin至受损线粒体外膜，引起线粒体泛素化。泛素化线粒体在P62等自噬调节蛋白作用下识别并结合自噬体膜上的LC3，聚集到双层自噬囊泡，形成线粒体自噬体，随后发展成自噬溶酶体，受损线粒体和过量的ROS在其中被降解，从而维持细胞的稳态。Hu Ting等研究发现竹荪多糖可通过清除ROS减少重金属诱导的PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬，发挥对细胞的保护作用。Cao Yiwen等研究表明芍药通过增加线粒体膜电位和减少ROS积累修复受损的线粒体，同时上调PINK1、Parkin、P62及LC3等线粒体自噬相关蛋白表达。以上所述研究与本研究结果相符合，GAP可减少线粒体损伤现象，增强线粒体膜电位水平，同时上调PINK1、Parkin、P62及LC3基因表达水平，表明其可能具有缓解Cd诱导线粒体自噬的潜力。

结 论

本研究建立Cd致HEK-293细胞损伤模型，分析GAP对细胞的保护作用。结果表明，2 μg/mL的Cd可降低细胞存活率、改变细胞形态、增加LDH释放量，表明Cd对细胞产生毒性作用。模型组细胞的SOD、GSH、CAT活性降低，ROS、MDA水平升高；下调HO-1、Nrf2且上调Keap1 mRNA的表达水平，表明Cd引发氧化应激反应，促进脂质过氧化。Cd处理会破坏线粒体结构并产生自噬现象，降低细胞线粒体膜电位水平，上调PINK1、Parkin、P62及LC3 mRNA表达量，从而促进细胞线粒体自噬。经过GAP干预后减轻了细胞的氧化损伤，降低细胞ROS水平、升高膜电位水平，从而调节Cd引起的线粒体过度自噬，可能与下调PINK1、Parkin、P62及LC3有关。综上所述，GAP能够通过缓解Cd诱导的氧化应激及线粒体过度自噬，对Cd造成人胚胎肾细胞的损伤具有保护作用。

作者简介

通信作者：

张清海，三级教授，贵州医科大学公共卫生与健康学院副院长，工学博士，博士生导师。入选贵州省高层次人才计划百层次人才、贵州省优秀青年科技人才。兼任贵州省食品科学技术学会副理事长、贵州省土壤与肥料学会常务理事、贵州省食品安全地方标准审评委员会委员、贵州省大健康学会食品营养专业委员会主任委员等。研究方向为食源性健康风险与干预，主持国家自然科学基金、贵州省科技支撑计划、贵州省科技重大专项子课题、贵州省国际科技合作项目等20余项，发表论文150余篇，其中SCI 35 篇。获贵州省科技进步二等奖1 项、三等奖2 项，贵州省科技成果转化二等奖1 项。


第一作者：

王林春，贵州医科大学公共卫生硕士研究生，研究方向为食用菌。

本文《黑灵芝多糖对镉致人胚胎肾细胞损伤的保护作用》来源于《食品科学》2025年46卷第11期217-224页，作者：王林春，唐丹丹，王曦禾，张清海。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241226-228。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：陈丽先；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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