基于微流控技术的scRNA-seq, 仅能拍摄细胞快照，天花板明显

万乘基因百万细胞级别scRNA-seq，可轻松快速获取全画幅高像素细胞表达谱

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超高通量单细胞转录组测序技术（sci-RNA-seq3）是当前生命科学领域的突破性技术，能够高效解析样本细胞组成，并在大规模单细胞水平上精确揭示基因结构和表达动态。而传统高通量转录组测序仅捕获 1~2 万细胞数，通量有限，往往只能检出丰度较高的细胞类型。与传统高通量转录组测序相比，万乘基因研发团队基于sci-RNA-seq3技术开发的商用10K超高通量scRNA-seq技术，具备百万级细胞检测能力，能全面解析组织复杂性，捕获稀有细胞类型。与此同时，超高通量将实验次数压缩至极简，造就了极低批次效应，使其更接近“高保真定量标准”。该技术凭借其超高通量、高分辨率和卓越的兼容性，将在肿瘤学、发育生物学、神经科学及精准医疗等领域发挥越来越重要的作用，推动生物医学研究进入单细胞大数据时代。

一、产品技术原理

10K超高通量scRNA-seq技术的基本原理是基于分池条形码编码（split-pool indexing），通过多轮索引为每个细胞引入一个独特的核酸组合标签，从而将海量起始细胞或细胞核的RNA同时进行条形码标记并建库测序，以实现对大量单细胞的并行分析，从单个实验中就能获得百万级别单细胞的转录组数据。

图1. 10K超高通量scRNA-seq实验原理图

二、产品特点

超高细胞通量

超广细胞类型检出

更多基因覆盖

超高性价比

三、产品应用领域

  • 肿瘤异质性研究：让每个癌细胞的“叛变计划”无所遁形

  • 发育生物学：胚胎分化的百万选择，高清“进度条”解析每个细胞的命运抉择

  • 神经科学：神经元类型的“人口普查”，解锁罕见神经元变异密码

  • 药物研发：单次实验百万细胞通量，加速候选药物“海选”赛

四、实测项目案例

利用万乘10K超高通量snRNA-seq技术对6~8周龄成年小鼠的脑样本进行检测，共获得约9万个细胞核的转录组数据。作为对比，万乘团队选取了两个公开数据集：

1）10x Genomics官网的小鼠脑细胞核snRNA-seq数据（Next GEM v3.1，数据集链接：https://www.10xgenomics.com/datasets/10k-Mouse-Brain-CNIK-3p-nextgem）；

2）Allen研究所发布的小鼠全脑组织单细胞公共数据集（10x平台v3.1，数据集链接：https://alleninstitute.github.io/abc_atlas_access/descriptions/WMB-10Xv3.html）。该数据集具有细胞数量庞大，覆盖鼠脑脑区范围广和注释信息全面等优势。

1.基础数据统计

采用万乘10K超高通量snRNA-seq技术对小鼠脑样本进行单细胞核测序，成功捕获约8万个细胞核的转录组数据。与10X Genomics鼠脑snRNA-seq相比，在相同测序深度下，万乘10K超高通量snRNA-seq技术展现出显著优势：

1）更高的转录本捕获效率：单细胞中位UMI数、单细胞基因中位数及总物种基因覆盖数均优于10X平台（表1.1）。

2）更优的测序饱和度：10K超高通量测序的饱和度显著低于10X平台，表明该技术能够更全面地捕获细胞核内的转录本，提高低丰度基因的检出率（表1.1）。

对比结果证明，万乘10K超高通量snRNA-seq在单细胞核测序的通量、灵敏度和基因覆盖度方面均优于传统10X平台，更适用于大规模单细胞核转录组研究。

表1.1 数据统计和比较

备注：为便于平台间横向比较，将10X原始数据（平均55,780 read pairs /cell）下采样至约17,817 read pairs /cell，与万乘10K超高通量数据测序深度匹配。

2.聚类与注释分析

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是研究细胞异质性的重要工具，但其应用受限于对高质量单细胞悬液的需求。对于脑组织、心脏、肌肉、脂肪等复杂组织或冷冻样本，往往难以获得足够数量且高活力的单细胞。相比之下，单细胞核RNA测序（snRNA-seq）通过直接分离细胞核进行建库，为这类难处理样本提供了可靠的替代方案。这两种方法各具特点：在样本处理方面，细胞核提取通常能获得更高的回收率。以小鼠肾脏组织为例，研究表明10毫克组织可提取1.5×106个细胞核 [1]，而相同质量的组织经酶解仅能获得7.18×10⁵个完整细胞（万乘基因内部实验数据）。在检测效果方面，多项研究表明scRNA-seq和snRNA-seq在主要细胞类型的鉴定上具有良好的一致性 [2-3]。因此，方法的选择应综合考虑组织特性和研究目的。

为评估万乘10K超高通量snRNA-seq技术在细胞分群和注释上的准确性，万乘团队选取公开数据集2为参照。从该数据集中随机选取约10,000个细胞，与鼠脑10K超高通量snRNA-seq数据进行比较分析。主要结论如下：

A）两个平台单细胞数据无系统性差异

10K与10x细胞整合聚类分析显示（图1.1），10K超高通量snRNA-seq数据能够完整覆盖10X scRNA-seq数据中的所有主要细胞类型，表明两种方法在主要细胞类型的鉴定上具有高度一致性。这一发现与既往研究结果相符，进一步验证了snRNA-seq技术即使在仅捕获细胞核转录本的情况下，仍能准确反映组织的细胞组成。

图1.1 10K超高通量与10X高通量整合的UMAP聚类展示

B）二者在细胞大类层面结果高度一致

使用SCANPY工具，采用相同的注释方法和标准对两组数据（10K超高通量snRNA-seq和10X scRNA-seq）进行细胞类型注释分析。结果显示：

1）细胞类型数量和种类：10K超高通量数据成功注释出31种细胞类型，10X数据注释出30种细胞类型，缺失脉络丛上皮细胞（choroid plexus epithelial cells）（图1.2）。两组数据在主要细胞类型的鉴定和数量上高度一致。

2）细胞类型占比：10K超高通量与10x数据在大多数细胞类型的比例分布基本一致，部分细胞类型在两组数据中的占比存在取样导致的细微差异（图1.3）。

上述结果表明，在细胞大类层面，10K超高通量snRNA-seq与常规10X scRNA-seq具有相当的细胞注释能力，且在某些细胞类型的检测上表现出更佳的灵敏度。

图1.2 10K超高通量与10X高通量的主要细胞类型注释聚类图

图1.3 10K超高通量与10X高通量的主要细胞类型比例分布

C）10K超高通量具有显著的细胞亚类识别优势

利用相同的聚类方法对细胞亚类进行亚聚类。聚类分析结果显示，10K超高通量平台展现出显著的细胞亚群鉴别优势。

1）聚类分辨率：10K超高通量数据获得382个cluster，10X数据仅获得164个cluster。在绝大多数主要细胞类型中，10K平台检测到的cluster数量显著多于10X（图1.4）。

2）稀有细胞检测能力：10K平台可稳定检测占比 < 0.1%的稀有cluster（如内皮细胞亚型Arterial endothelial cells占比0.0696%，静脉内皮细胞亚型Venous endothelial cells占比0.0369%，二/三层脑内神经元亚型Layer 2/3 intratelencephalic neurons 占比0.0873%）。相同阈值下，10X平台未能检测到这些极低丰度细胞类型（图1.5）。

上述对比充分证明，相较于传统10X平台，10K超高通量snRNA-seq具备以下突出优势：

1）显著提升细胞亚型分辨能力；

2）突破性地提高稀有细胞检出灵敏度；

3）为发现新型细胞亚群和稀有细胞群体提供了强有力的技术支撑。

图1.4 10K超高通量与10X高通量的细胞大类对应的亚类注释数目统计

图1.5 10K超高通量与10X高通量的细胞亚类占比分布

备注：Count（计数）：Y轴表示：每个 bin（区间）中包含的细胞类型数量。Percent（百分比）：Y轴表示：每个 bin 中的细胞类型数量占总数的百分比，所有柱子高度加起来为 100%。10X和10K各自分开计算。Density（密度）：Y轴表示：频率密度，使得直方图的面积和为 1。

进一步对小鼠脑皮质投射神经元1（cortical projection neurons 1）这一主要细胞类型进行了深入的亚群分析，结果显示：10K超高通量平台鉴定出42个显著差异的cluster，10X平台仅区分出15个cluster（图1.6）。该结果进一步验证了10K超高通量技术在神经元亚型精细分群方面的卓越性能，能为神经科学领域的新型神经元亚群发现和功能研究提供更强大的技术支撑。

进而对cortical projection neurons 1的cluster进行对比分析，10K超高通量snRNA-seq技术鉴定出许多特有的cluster，例如Layer 6 corticothalamic neurons，Layer 6 corticothalamic & subplate-like neurons，Layer 5 intratelencephalic neurons 和Layer 2/3 intratelencephalic neurons等（图1.7）。这些cluster与脑的发育和功能有着紧密的关系。例如Layer 6 corticothalamic neurons（第6 层皮质丘脑神经元） 在大脑皮层与丘脑之间的信息传递中起着关键的调节作用。常规高通量的scRNA-seq可能漏检低丰度转录本（如神经肽或受体基因），导致亚型关键标记缺失和注释难度。而10K超高通量snRNA-seq技术，鼠脑单样本捕获8万多细胞核的转录本，极大地提升了分辨率，成功检测和鉴定到此类cluster。Layer 6 corticothalamic & subplate-like neurons （第6 层皮质丘脑及类似亚板神经元）在丘脑-皮层环路中扮演关键角色，涉及感觉信息调控、皮层发育、神经可塑性及节律生成。标志基因非特异性，发育动态变化以及较低通量细胞的检测成为其检测和注释的主要限制因素。10K超高通量细胞snRNA-seq信息在发现这类低丰度亚型和解析细胞状态连续变化方面具有明显优势，特别适合这类高度异质的区域。

图1.6 10K超高通量与10X高通量数据中cortical projection neuron 1细胞大类中亚类聚类图

图1.7 10K超高通量数据中cortical projection neuron 1细胞大类中特有亚类聚类图

小结

本案例采用万乘10K超高通量scRNA-seq平台，单次实验成功捕获约8万鼠脑细胞核的snRNA-seq数据。通过与10X微流控平台的scRNA-seq数据对比分析，发现万乘超高通量技术具有以下显著优势：

技术性能方面：

单样本即可实现超高细胞通量捕获；

转录本检测效率优于10X平台。

科学发现价值：

突破性地提高了稀有细胞类型的检出能力；

可检测到现有scRNA-seq技术难以覆盖的极低丰度细胞亚群。

上述结果表明，万乘10K超高通量scRNA-seq技术不仅在数据产出规模上实现了量级突破，更在稀有细胞检测这一科研关键需求上展现出独特的技术优势，为单细胞研究提供了更强大的工具。

五、应用文章

洛克菲勒大学曹俊越课题组利用超高通量单细胞转录组技术（单细胞组合索引方法）对来自5个年龄段，共93只小鼠的13种器官，包括肺、心脏、肝脏、肾脏、肌肉、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、棕色脂肪、腹股沟脂肪和生殖腺脂肪共623个组织样本的逾2,000万个细胞的转录状态进行了研究。研究覆盖了从成年到老年的五个生命阶段，并在每个阶段严格保证性别均衡采样。由于不同性别个体在衰老过程中呈现出显著的分子和细胞差异，这种性别均衡的采样设计对研究衰老机制至关重要，也确保了研究结果更具普遍性。研究获得的全面的数据集揭示了200多种与衰老相关的细胞群，揭示了在生命进程中，组织、谱系和性别特异性的细胞动态变化，为深入理解衰老及相关疾病的分子机制、制定个性化的治疗干预策略奠定理论基础。

六、参考文献

[1] Li H, Humphreys BD. Mouse kidney nuclear isolation and library preparation for single-cell combinatorial indexing RNA sequencing. STAR Protoc 3(4), 101904 (2022).

[2] Slyper, M., Porter, C.B.M., Ashenberg, O. et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med 26, 792–802 (2020).

[3] Oh, JM., An, M., Son, DS. et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp Mol Med 54, 2128–2134 (2022).

七、扩展阅读

目前超高通量scRNA-seq技术已经成功应用到发育，神经类疾病，衰老，药物研究等领域。部分参考文献如下：

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