为什么很多 RNA-seq 分析，最后只能得到「一堆差异基因」？RNA-seq 分析最难的不是得到差异基因，而是证明这些差异真实存在，并解释它们意味着什么。

除了要熟悉 RNA-seq 的顺序：测序公司发送数据——下载表达矩阵——运行 DESeq2——获得差异基因——绘制火山图——GO/KEGG 富集——文章完成。

更要了解：「这些差异基因是否可靠？」、「样本之间是否存在批次效应？」、「这些通路变化是否具有生物学意义？」、「你的分析如何支持后续机制研究？」

如何准备样本、设置分组

假设我们研究：某药物是否能够改变肿瘤细胞的转录状态？

实验设计：

  • Control 组（Ctrl_1、Ctrl_2、Ctrl_3）

  • Treatment 组（Treat_1、Treat_2、Treat_3）

经过 RNA 测序后，我们获得了一个巨大的表达矩阵：

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图 1：表达矩阵

RNA-seq 完整分析流程：从测序数据到候选机制

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图 2：RNA-seq 完整分析流程（ChatGPT）

一个标准 RNA-seq 分析流程通常包括：

Raw sequencingdata——质量控制（QC）——比对/定量——Gene Count Matrix——样本质量评价——PCA 聚类分析——差异表达分析（DEG）——火山图/热图——GO/KEGG——候选机制发现——实验验证

RNA-Seq 分析的第一步：Gene Count Matrix

通常我们从测序公司拿到的是 Gene-level raw count 矩阵。表格里的每个数字，代表测序读段（reads）被比对到某个基因上的原始数量。如下：

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⚠️ 一个提醒：

很多初学者拿 TPM 或 FPKM 直接跑 DESeq2——这是错的。

因为 DESeq2 的设计输入是原始 count，它会自己完成：测序深度校正、样本间标准化、统计模型拟合。直接输入标准化后的表达值，反而会破坏 DESeq2 内置的统计假设。

PCA 分析：RNA-seq 最重要的质量控制工具

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图 3：PCA 分析示意图（https：//blog.csdn.net/telasi2004/article/details/142501798）

PCA（Principal Component Analysis，主成分分析）的作用：确认实验组和对照组是否真的存在整体表达差异：同一组的样本，应该聚在一起；不同组的样本，应该分开

（PCA 通常被用于 RNA-seq 探索性分析和质量控制，用于观察样本间主要变异来源及分组聚类情况）

DESeq2：RNA-seq 差异分析最常用工具之一

DESeq2 基于基因表达水平、样本间差异、测序深度、生物学变异，最终输出差异基因：

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图 4：DESeq2 分析后的差异基因

我们通过筛选设置阈值进行分析，主要关注两个指标：

  • Fold Change（倍数变化）：查看实验组的表达量是控制组的几倍。为例如：如果，说明表达量翻倍（上调）；如果等于，说明表达量减半（下调）。

  • FDR / P-adj（校正后的 P 值）：这个差异是否真实，因为我们同时对两万个基因做检验（多重假设检验），极容易出现「假阳性」。建议看校正后的 P-adj（通常要求）。

结果可视化（可以利用在线网站分析，也可以在 R 中分析）

1、火山图：寻找差异基因

它将基因的「变化幅度」和「统计学显著性」完美结合在了一张图里。

  • 横轴：（表达量的变化倍数）。越靠右表示上调倍数越大，越靠左表示下调倍数越大。

  • 纵轴：（显著性水平）。点的位置越高，说明差异越具有统计学意义。

  • 参考线：通常会画两条竖虚线和一条横虚线作为阈值。

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图 5：火山图（https：//blog.csdn.net/qq_37148940/article/details/141564354）

2、聚类热图（Heatmap）：基因表达模式全景图

热图是用来聚焦你筛选出的核心基因集，看它们在不同样本里的相对变化趋势。

  • 行与列：通常每一行代表一个基因，每一列代表一个样本。

  • 颜色阶梯：颜色代表表达量标准化（如 Z-score）后的高低。通常红色代表高表达，蓝色代表低表达。

  • 聚类树（Dendrogram）：顶部和左侧像树枝一样的线条，代表样本间或基因间的相似性聚类结果。

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图 6：聚类热图（https：//blog.csdn.net/qq_41909309/article/details/103595682）

3、GO 富集条形图（Barplot）

横轴通常是富集到该通路的基因数量（Count），纵轴是通路的名称。颜色的深浅通常代表 P 值或 q 值的大小（越红越显著）。

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图 7：GO 富集条形图（https：//www.zhihu.com/zvideo/1397273860954296320）

4、KEGG 气泡图（Dotplot）

横轴是 GeneRatio（富集到该通路的差异基因数 / 差异基因总数），气泡的大小代表基因数量，气泡的颜色代表显著性。

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图 8：KEGG 气泡图（https：//blog.csdn.net/MurphyStar/article/details/129683996）

编辑：小 z

题图：自制