全球健康危机催生新型疗法

抗菌素耐药性（AMR）已成为威胁人类健康的重大挑战，尤其使伤口感染难以根治。铜绿假单胞菌作为常见耐药病原体，能形成顽固生物膜，抵御抗生素及宿主免疫系统。尽管益生菌、纳米颗粒等替代疗法不断涌现，但其稳定性、毒性及缺乏靶向性等问题仍限制临床应用。近一个世纪前提出的噬菌体疗法因能精准裂解特定菌株而复兴，却面临噬菌体抗性、递送效率低、体内存留时间短等瓶颈。

智能水凝胶实现“按需治疗”

瑞士联邦材料科学与技术研究所（EMPA）任群教授团队开发出一种明胶基生物响应性水凝胶（ΦxGel），可靶向递送噬菌体鸡尾酒治疗耐药性铜绿假单胞菌感染。该水凝胶通过席夫碱交联技术避免损伤噬菌体活性，并能被细菌分泌的明胶酶特异性降解，实现感染部位的按需释放。封装的双噬菌体（FJK.R9-30与MK.R3-15）协同作用：前者广谱杀菌，后者专攻前者的耐药突变株，彻底抑制生物膜形成并瓦解已形成的生物膜。离体人体皮肤模型验证其特异性与安全性，且对真皮成纤维细胞无毒性。

智能递送系统设计

ΦxGel通过双注射器注入伤口，在体温下快速交联成型，完美贴合不规则创面。当铜绿假单胞菌在感染部位增殖时，其分泌的明胶酶（如LasB弹性蛋白酶）水解明胶骨架，触发噬菌体释放。FJK.R9-30（红色）主攻普通菌株，而对其产生抗性的细菌会被MK.R3-15（绿色）精准清除，形成“抗性抵消”协同机制。

图1. 噬菌体鸡尾酒抗耐药铜绿假单胞菌感染的生物响应性递送系统示意图 A) 注射与治疗机制 双注射器共推注明胶-酰肼（Gelatin-ADH）、DF-PEG及双株噬菌体鸡尾酒（FJK.R9-30红色，MK.R3-15绿色），通过温和席夫碱化学原位凝胶化，贴合不规则伤口。水凝胶作为稳定储库，接触铜绿假单胞菌或其分泌物时降解，实现噬菌体"按需释放"。FJK.R9-30提供广谱杀伤，MK.R3-15清除对FJK.R9-30耐药的细菌，协同作用。 B) 酶触发机制 活菌分泌蛋白酶（尤指明胶酶）切割明胶骨架（蓝色），破坏网络、扩大孔隙，加速包封噬菌体的向外扩散。

水凝胶性能优化

提高交联剂DF-PEG（5%→15%）或明胶衍生物Gel-ADH（5%→15%）浓度可缩短凝胶时间至2分钟，并提升储能模量（≈10⁴ Pa），形成强韧而柔性的网络。扫描电镜显示15% Gel-ADH水凝胶具备稳定多孔结构，利于营养物质交换。其优异的可注射性与粘附性使其在猪皮弯曲、扭转下仍保持完整，适用于动态伤口环境。

图2. 水凝胶表征 A,B) DF-PEG (A) 和 Gel-ADH (B) 浓度对凝胶时间的影响：增加交联剂或聚合物浓度通过提供更多酰腙键反应位点缩短凝胶时间。 C) 15% DF-PEG和Gel-ADH在流变仪上≈2分钟凝胶。 D) 试管倒置试验：浓度越高凝胶越快。 E) 频率扫描显示高浓度组分使储能模量达≈10⁴ Pa，形成强韧弹性网络。 F) 冻干水凝胶SEM：Gel-ADH浓度越高，多孔结构越稳定（5%易塌陷→15%网状互联）。 G(i-iv) 离体伤口模型展示快速原位凝胶与形貌贴合。 H(i-iv) 水凝胶在猪皮弯曲扭转下牢固粘附。

病原体响应性降解

铜绿假单胞菌浓度直接调控降解速度：OD₆₀₀=0.1时，15%水凝胶12小时内完全降解；OD₆₀₀=0.01时降解需24小时。细菌分泌的热敏感金属蛋白酶是关键驱动力——过滤除菌的培养上清液可诱导降解，而热处理或添加金属蛋白酶抑制剂（1,10-菲啰啉）则阻断该过程。壳聚糖水凝胶在相同条件下无降解，证实明胶为酶解特异性靶点。

图3. Gel-ADH水凝胶被铜绿假单胞菌及其分泌物降解 A) 铜绿假单胞菌全覆盖琼脂板上的初始完整水凝胶（t=0 h）。 B) 孵育24小时后结构明显降解。 C) 降解实验设置：不同浓度水凝胶（5%,10%,15%）及未交联明胶对照。 D) 时序图像：低浓度水凝胶在菌层上降解更快（5%始于2h，15%始于8h）。 E) 溶胀测试：高浓度水凝胶在TSB中稳定，在铜绿假单胞菌培养液中快速降解。 F) 水凝胶在活菌存在下降解示意图。 G) 细菌浓度越高降解越快；热处理上清液显著抑制降解，提示热敏感酶主导过程。 H) 细菌分泌物降解水凝胶示意图。

噬菌体鸡尾酒克服耐药性

单一噬菌体FJK.R9-30虽初始抑菌强，但16小时后耐药菌增殖失控。MK.R3-15单独使用无效，却能有效清除FJK.R9-30的耐药株。关键发现：双噬菌体同步投递（非序贯投递）在4小时内完全裂解细菌，48小时无复发。这种策略通过同时靶向不同受体，阻断细菌进化出双重抗性的路径。

图4. 噬菌体FJK.R9-30、MK.R3-15及鸡尾酒对耐药铜绿假单胞菌Paer09的效价影响 A) 不同效价FJK.R9-30均显示相似抑菌模式，16小时后细菌再生（耐药性出现）。 B) 再生菌对新加入FJK.R9-30无响应，证实耐药性存在。 C) 共孵育24小时后噬菌体效价显著增加，排除噬菌体失活导致再生。 D) MK.R3-15单独使用不抑制Paer09。 E) 序贯投递MK.R3-15可抑制耐药菌，但12小时后再现再生（新耐药性）。 F) 双噬菌体同步投递4小时内完全裂解细菌，48小时无再生。 G) 单噬菌体治疗导致耐药菌再生机制。 H) 同步鸡尾酒疗法预防耐药机制。

高效封装与可控释放

席夫碱交联的ΦxGel保持噬菌体高存活率（＞90%），而传统甲基丙烯酸化明胶（GelMA）因紫外自由基损伤活性。在离体皮肤模型中，封装噬菌体120小时后活性仅轻微下降，远优于裸露噬菌体。释放实验表明：铜绿假单胞菌培养上清液（OD₆₀₀=1）触发4小时内噬菌体突释；活菌持续分泌酶进一步加速释放（OD₆₀₀=0.1时释放率达90%）。噬菌体结构差异影响扩散速度——头径更小的FJK.R9-30（≈60 nm）比MK.R3-15（≈90 nm）释放更快。

图5. 包封噬菌体从水凝胶的封装效率与释放曲线 A) Gel-ADH封装噬菌体存活率与游离噬菌体相当，GelMA显著降低效价。 B) 4℃储存稳定性：封装/游离噬菌体均保持高活性。 C) 离体皮肤模型：封装噬菌体120小时后活性显著高于游离组。 D,E) 铜绿假单胞菌上清液中FJK.R9-30 (D) 和MK.R3-15 (E) 的释放曲线。 F) 上清液酶触发释放示意图。 G,H) 活菌加速T7 (G) 和T4 (H) 噬菌体释放（OD越高释放越快）。 I) 活菌持续分泌酶加速降解示意图。 J-M) FJK.R9-30 (J)、MK.R3-15 (K)、T7 (L)、T4 (M) 电镜图（标尺100 nm）。

强力抗菌与抗生物膜

含噬菌体鸡尾酒的水凝胶（ΦxGel）在4小时内完全清除浮游菌，即使低剂量（10³ PFU/mL）也能抑制99%以上生物膜形成。对已形成的生物膜，ΦxGel使菌量降低2个数量级（99%），活/死染色显示死菌比例显著增加。琼脂扩散实验证实其针对不同菌株（Paer09、Paer03）均产生明显抑菌圈。

图6. 噬菌体鸡尾酒（直接/水凝胶递送）的抗菌抗生物膜性能 A) PDMS表面生物膜结晶紫染色：低浓度鸡尾酒显著抑制成膜。 B) 570 nm吸光度定量：鸡尾酒使生物膜形成率趋近于零。 C) 水凝胶包封鸡尾酒4小时内清除浮游菌。 D,E) 琼脂扩散实验：含噬菌体水凝胶（ΦxGels）在Paer09 (D) 和Paer03 (E) 板上产生抑菌圈。 F) ΦxGels使预形成生物膜的菌量降低＞2 log。 G) 生物膜活/死荧光成像：绿色活菌，红色死菌（标尺50 μm）。

生物相容性保障

人真皮成纤维细胞与ΦxGel共培养后保持正常形态，细胞活性＞95%。溶血率＜2%（安全阈值），且红细胞结构完整，满足伤口接触要求。噬菌体鸡尾酒本身无细胞毒性，并能减轻铜绿假单胞菌对细胞的损伤。

图7. 噬菌体鸡尾酒及ΦxGels对人真皮成纤维细胞（nHDFs）的细胞相容性 A) 形态学评估：单独噬菌体鸡尾酒（Φx）组细胞健康；铜绿假单胞菌（P.a.）组细胞毒性显著；联合治疗减轻损伤。 B) CCK-8定量：噬菌体维持高细胞活性并缓解细菌毒性。 C) 空白凝胶与ΦxGels提取物培养下细胞活性均＞95%。 D) 溶血率：所有材料均＜2%安全阈值（TritonX为阳性对照）。

离体皮肤验证临床潜力

在感染铜绿假单胞菌的人体皮肤上，ΦxGel因细菌酶解而降解，但速度慢于不含噬菌体的对照组——释放的噬菌体裂解细菌后，酶分泌减少形成自调节循环。未感染区域水凝胶48小时保持稳定。组织学与菌落计数证实：ΦxGel完全预防生物膜形成，对已形成的生物膜也能降低99%菌量。

图8. ΦxGels在离体皮肤上的降解与抗生物膜验证 A) 水凝胶降解：未交联组2小时融化；空白凝胶在感染皮肤24小时完全降解；ΦxGels因噬菌体杀菌减缓降解。 B) H&E染色：ΦxGels完全预防生物膜形成（首行），但对已形成生物膜仅部分清除（次行）（标尺200 μm）。 C) 菌落计数：ΦxGels组未检出细菌，空白凝胶组菌量高。 D) ΦxGels使已形成生物膜的病原体效价降低≈2 log。

未来展望：精准对抗耐药菌新时代该水凝胶通过病原体特异性响应释放与双噬菌体协同策略，突破噬菌体疗法的耐药性与递送瓶颈。其可扩展性强：例如针对产透明质酸酶的金黄色葡萄球菌，可设计透明质酸基水凝胶实现类似靶向治疗。这项技术为耐药菌感染提供了安全、高效且持久的解决方案，有望成为抗击AMR危机的关键武器。

来源：高分子科学前沿

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