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水质中大肠菌群检测之多管发酵法
总大肠菌群是一群在 37℃条件下能发酵乳糖、产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，其生理特性与肠道致病菌存在一定关联，因此其存在往往提示水体可能受到粪便污染，进而可能存在肠道致病菌污染的风险。基于这一特性，总大肠菌群成为评价水体卫生状况的重要指示菌。多管发酵法作为检测总大肠菌群的经典方法，凭借其对微生物发酵特性的合理利用以及严谨的鉴定步骤，能较为准确地判断水样中总大肠菌群的存在及数量情况，在环境监测、水质检测等领域有着不可替代的地位，尤其适用于对各类水源水、饮用水及污水等的卫生学评价。
多管发酵法的核心原理是基于总大肠菌群发酵乳糖的特性。检测时，首先要进行水样的接种操作。水样需按照不同的稀释梯度进行稀释，一般会设置多个稀释倍数，如 10 倍、100 倍、1000 倍等。这是为了适应不同污染程度的水样检测需求 —— 污染较轻的水样，其中总大肠菌群数量相对较少，可选择较低稀释度；污染较重的水样，总大肠菌群数量较多，需更高稀释度，以保证后续培养能出现可观察的阳性结果，避免因菌群数量过多导致所有试管都出现阳性而无法准确计数。之后将不同稀释度的水样分别接种至特定的培养基中，每个稀释度通常会接种多支试管，以提高检测结果的准确性。常用的培养基有乳糖蛋白胨培养液，这种培养基中的蛋白胨能为总大肠菌群提供氮源、维生素和生长因子等营养物质，乳糖则是诱导菌群发酵的关键底物，同时培养液中的缓冲物质能在一定程度上维持环境的稳定性。
接种完成后，把接种好水样的培养基置于 36℃±1℃的恒温培养箱中培养 24 小时。培养过程中需保证培养箱温度稳定，可通过定期检查培养箱温度显示、校准温度控制系统等方式实现，避免温度波动影响菌群活性 —— 温度过高可能破坏菌群的细胞结构，导致菌群死亡；温度过低则会降低菌群的代谢速率，抑制发酵作用。在这个培养阶段，如果水样中存在总大肠菌群，该菌群就会利用培养基中的乳糖进行发酵。发酵过程中产生的酸性物质会使培养基的 pH 值下降，原本呈中性或弱碱性的培养基会逐渐偏向酸性。若培养基中添加了溴甲酚紫等指示剂，由于指示剂在不同 pH 值环境下会呈现不同颜色，会观察到颜色由紫变黄的明显变化，这是判断产酸的直观依据；同时产生的气体则会积聚在培养基中倒置的小导管内，通常可以通过观察小导管内是否有气泡以及气泡占导管体积的比例来判断产气情况，一般来说，只要小导管内有可见气泡，就可视为产气阳性。
当培养 24 小时后，若培养基出现产酸（通过培养基颜色变化等方式观察）产气现象，说明该培养物有存在总大肠菌群的可能，但此时还不能完全确定，因为部分非目标菌群，如某些革兰氏阳性菌在特定条件下也可能出现类似反应，所以需要进一步的鉴定确认。接下来便进入证实试验环节，用经过灭菌处理的接种环从产酸产气的培养物中取少量菌液，转种到新的乳糖蛋白胨培养液中，接种过程需严格遵循无菌操作规范，避免外界杂菌污染。同样在 36℃±1℃条件下培养 24 小时，观察是否再次出现产酸产气现象。这一步的目的是排除偶然因素导致的假阳性结果，若再次出现产酸产气现象，说明目标菌群存在的可能性大幅提升。

即便通过了证实试验，还需进行革兰氏染色检测以做最终确认。操作时取证实试验阳性的菌液涂片，将菌液均匀涂抹在载玻片上形成薄层，待自然干燥后进行固定，可通过火焰固定法，即手持载玻片一端，将有菌膜的一面通过火焰 2-3 次，以杀死细菌并使其牢固附着在载玻片上。之后依次进行结晶紫初染 1 分钟，使细菌细胞着色；用清水冲洗后，进行碘液媒染 1 分钟，碘液与结晶紫结合形成复合物，增强染色效果；再用 95% 酒精脱色 30 秒左右，直至流出的液体无色为止，革兰氏阴性菌的细胞壁结构较疏松，复合物易被洗脱，而革兰氏阳性菌细胞壁结构致密，复合物不易被洗脱；最后用番红复染 1 分钟，使脱色后的革兰氏阴性菌重新着色。总大肠菌群为革兰氏阴性无芽孢杆菌，染色后在显微镜下呈红色短杆状，且无芽孢结构；而革兰氏阳性菌会呈现紫色，芽孢杆菌则能观察到芽孢形态，通过染色结果可以排除这些非目标菌群的干扰，确保检测结果的特异性。
通过上述一系列步骤，对培养过程中出现产酸产气现象的培养物进行全面确认后，结合接种水样的体积和不同稀释度的试管数量，对照总大肠菌群最可能数（MPN）表进行计数。MPN 表是根据统计学原理制定的，它综合考虑了不同稀释度下阳性试管的数量，能通过阳性试管数量推算出每 100 毫升水样中总大肠菌群的最可能数量。例如，当某个稀释度下的阳性试管数量符合 MPN 表中的对应数值时，便可得出相应的菌群数量范围，从而最终判断水样中是否存在总大肠菌群以及具体数量情况。

多管发酵法以其科学的原理和规范的操作流程，在总大肠菌群检测领域得到了广泛应用。虽然操作相对繁琐，涉及稀释、接种、多次培养及染色等多个步骤，且检测周期较长，从开始到得出结果通常需要数天时间，但它能直观反映菌群的生理特性，结果可靠性高，能较好地满足水体卫生监测对准确性的要求。该方法为水体卫生监测提供了可靠的技术支持，助力相关部门及时掌握水质卫生状况，当检测出总大肠菌群数量超标时，可及时采取针对性的污染防控措施，保障水体安全。