基于泊松分布模型的荧光重组呼吸道合胞病毒感染滴度测定

中文摘要

目的建立快速、简便和准确地检测表达绿色荧光蛋白的重组呼吸道合胞病毒（recombinant respiratory syncytial virus expressing the enhanced green fluorescent protein，RSV-EGFP）感染滴度的方法。

方法以反向遗传学构建的RSV-EGFP为研究对象、流式细胞术为检测方法，建立以泊松分布为基础的数学模型并做曲线拟合，以数学模型中的预设参数进行病毒感染滴度计算。

结果成功建立了基于泊松分布的病毒感染数学模型和流式细胞术检测RSV-EGFP感染滴度的新方法。与传统的荧光显微镜计数法比较，检测结果差异无统计学意义（t=0.16，P=0.879）；6次测定结果的变异系数为10.42%（荧光显微镜计数法为60.44%），重复性好。

结论建立了适用于RSV-EGFP感染滴度测定的新方法，可为其他病毒感染滴度的测定方法研究提供参考。

正文

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染是婴幼儿与老年人下呼吸道感染的主要病因之一。目前已有3种RSV疫苗获批上市。RSV疫苗和预防性药物旨在诱导强大的RSV中和免疫应答，研究表明抗RSV中和抗体可针对RSV引起的严重下呼吸道疾病提供被动保护，验证了抗RSV中和抗体与预防保护的相关性。WHO也支持使用抗RSV中和抗体检测作为评估RSV疫苗免疫原性的初步方法，即作为RSV预防保护性的主要血清学标志。目前，表达绿色荧光蛋白的重组RSV（recombinant RSV expressing the enhanced green fluorescent protein， RSV-EGFP）已被广泛用于RSV疫苗中和抗体的测定。据文献报道，在基于RSV-EGFP建立的中和实验方法中，荧光病毒输入量会显著影响检测结果，准确测定病毒感染滴度对于中和实验的结果至关重要。

由于噬斑法、荧光显微镜计数法等传统检测方法操作比较复杂，实验周期长，客观性差，因此有必要建立更科学的RSV-EGFP感染滴度检测方法。本研究拟基于泊松分布模拟RSV-EGFP感染细胞的数学模型，建立可靠、准确、简便的应用流式细胞术检测RSV-EGFP感染滴度的方法。

1

材料与方法

1.1

细胞

Vero细胞购自美国典型培养物保藏中心，由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室保存并提供。

1.2

病毒

RSV-EGFP购自美国ViraTree公司，由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室保存并提供。

1.3

主要试剂及仪器

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自南京诺唯赞股份有限公司；L-谷氨酰胺、DMEM培养基、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；96孔细胞培养板和细胞培养瓶均购自美国Thermo Fisher公司；青霉素-链霉素-两性霉素B添加剂购自武汉赛维尔生物科技有限公司。12道移液器（15～300 μL）购自德国Brand公司；CO2培养箱购自德国Memmert公司；IX71荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；BD Accuri™ C6流式细胞仪购自美国BD公司。

1.4

荧光显微镜计数法

用胰蛋白酶消化培养瓶中的Vero细胞，用病毒培养基（DMEM+体积分数5% FBS+2 mmol/L L-谷氨酰胺+体积分数1%链霉素-青霉素-两性霉素B添加剂）稀释细胞浓度至5×105 mL-1，接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL细胞悬液。将RSV-EGFP在37 ℃水浴中快速融化，低温下在离心管中进行梯度稀释（从1∶10开始10倍稀释至1∶1010），将不同稀释度的病毒液加至96孔细胞培养板与细胞悬液混合，总体积200 μL。每个稀释度重复3个孔，同时设置阴性对照孔（只加病毒培养基不加病毒液），37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h。将96孔细胞板置于荧光显微镜下观察，若阴性对照成立，则用最后出现阳性细胞孔及相邻稀释度孔的阳性细胞数量结合稀释倍数计算感染滴度，病毒感染滴度〔荧光灶单位（fluorescence focus unit，FFU） /mL〕=阳性细胞数×稀释倍数×10，并将2个相邻稀释度得到的病毒滴度结果取均值，即为病毒原液的最终感染滴度。

1.5

泊松分布法

1.5.1　数学模型建立本数学模型的建立基于泊松分布。泊松分布主要用于描述单位时间（空间）中稀有事件的发生数。随机变量X服从泊松分布，是指X取值范围为0、1……，其相应取值概率为P（λ为常数，其数学意义为分布平均数）：

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泊松分布是模拟病毒感染单细胞层面最适合的数学模型之一。由于病毒的体积相对于细胞极小，因此当一定量的病毒感染单细胞层面时，可看作一定区域内某种微生物的计数分布。将病毒培养的时间控制在20~24 h，此时病毒还未完成出芽生殖释放，子一代病毒不会感染其他细胞，即使感染也不会马上表达EGFP，故在某一确定的感染复数（multiplicity of infection，MOI）下，1个细胞被k个病毒感染的概率为：

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每个细胞被感染的概率P，即细胞至少被1个病毒感染的概率P（X≥1）为1-P（X=0）：

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此时病毒感染的个体概率P可以用于二项分布法则中，以预测在给定MOI下被感染的细胞比例。由于事件的总数相对较高（细胞接种数为5×104），可以认为独立事件符合正态分布，则从宏观角度来看，在此MOI下，细胞的感染率（%）即为：

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假设样品中实际的病毒感染滴度为m，实验前m未知，假定其滴度为n，此处引入1个参数B，且m=B×n。根据假定值n将样品稀释成不同滴度，结合细胞计数得到不同的MOIn，则MOI=B×MOIn（MOI为对应于m的实际值，MOIn为根据假定值n得到的表观值），将其代入上式。同时被感染的细胞中可能有一定比例状态不好，病毒感染后不能表达出报告基因编码的蛋白，从而呈现假阴性，故引入参数A来反映EGFP生成效率，即感染率为：

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此即为所建立的数学模型，通过曲线拟合得到B值，即可计算样品的感染滴度。

1.5.2　实验方法建立取对数生长期的Vero细胞，用病毒培养基稀释细胞浓度至5×105 mL-1，取100 μL/孔细胞悬液接种于96孔细胞培养板。

将待检测的RSV-EGFP（假定滴度为n）用病毒培养基按MOIn=50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.000、0.500、0.250稀释。将100 μL不同稀释度的病毒液加至96孔细胞培养板，与细胞悬液混合，每个MOI重复3个孔。37 ℃、5% CO2培养24 h。弃去旧培养基，PBS洗涤1遍，加入胰蛋白酶消化细胞（50 μL/孔），37 ℃放置30 s，显微镜下观察细胞，消化完全（变成单个圆形细胞）后加入含有体积分数5% FBS的PBS中和胰蛋白酶（50 μL/孔），将细胞吹散，加入质量分数4%的多聚甲醛（100 μL/孔），室温固定15 min。

固定完成后，再次吹打细胞，镜下观察细胞已经吹散均匀后进行流式细胞上机检测。流式细胞术上样速度为中速，每个孔收集10 000个细胞。调整前向散射光与侧向散射光的电压，使目标细胞群独立处于适当位置，将所需要分析的目标细胞群圈门，与细胞碎片分开。用阴性对照设门，使得阴性对照接近100%处于门内，则阴性对照门外为阳性。计算出每孔阳性细胞的百分比，将3个平行孔的结果求均值，即为该MOIn下的感染率。

1.6

数据分析

数据分析采用Curve expert 1.4软件，将所建立的数学模型进行Python语言转换导入Curve expert 1.4软件的自定义用户模型进行曲线拟合，以MOIn为横坐标、感染率为纵坐标，做曲线拟合，得到参数A和B，计算病毒实际滴度。

2

结果

2.1

荧光显微镜计数法检测结果

荧光显微镜下每1个阳性细胞代表1个有感染能力的病毒（图1）。该实验共进行6次，取其中1次的结果为例作详细描述，如表1所示。

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对同一样品连续测定6次，结果分别为3.8×106、1.8×106、3.1×106、5.9×106、7.4×106、1.4×106 FFU/mL。6次测定结果的x̅±s为（3.9±2.4）×106 FFU/mL，变异系数（coefficient of variation，CV）为60.44%。

2.2

泊松分布法结果

该实验共进行6次，取其中1次的结果为例详细描述。接种的细胞数为5×104个/孔，假定病毒的感染滴度n=5×107 FFU/mL（假定值n可根据预估值任意设定，为了稀释方便，本实验设置为细胞的整数倍）。各MOIn对应的流式直方荧光图如图2所示（未展示复孔），阳性细胞（FL1-A+）百分比见表2。

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使用建立的数学模型进行曲线拟合，见图3。病毒较少时，MOIn与细胞感染率呈正线性关系，随着病毒增多，细胞感染率逐渐达到平台，说明本实验建立的数学模型符合病毒感染细胞的一般特点。本次实验中，所得拟合曲线决定系数＞0.999，拟合参数A=0.736 6，B=0.079 6。根据m=B×n，感染滴度为4.0×106 FFU/mL。

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针对同一样品连续测定6次，结果分别为4.0×106、4.6×106、3.7×106、4.2×106、4.3×106、3.4×106 FFU/mL。6次测定结果的x̅±s为（4.1±0.5）×106 FFU/mL，CV=12.93%。2种检测方法的检测结果差异无统计学意义（t=0.16，P=0.879）。

3

本研究建立了1种RSV-EGFP感染滴度测定的新方法，该法与传统的荧光显微镜计数法相比，具有结果客观和精密度高等优点。

荧光显微镜观察法通过最后1个有荧光细胞出现的孔的细胞数得出结果，此时的细胞孔往往稀释度很高，难以避免由此导致的稀释误差；而新建立的泊松分布模型法通过采用多个稀释度的感染率进行曲线拟合，弥补了高倍稀释导致误差大的缺点。

荧光显微镜计数法需要实验者在荧光显微镜下对细胞孔进行全视野计数，容易产生视觉疲劳且需要主观判断阳性细胞，造成不同实验操作者结果差异很大。本研究建立的泊松分布模型法采用流式细胞仪进行计数，客观性更强，且更加简便。其次，由于细胞需培养24 h，在此过程细胞（包括感染细胞和非感染细胞）会分裂，镜下观察常见多个荧光细胞连接的现象，难以区别是单个阳性细胞分裂还是2个独立的阳性细胞，给结果造成很大的误差；而流式细胞术测定的是阳性细胞的百分比（细胞分裂前后，阳性比不会改变），避免了细胞分裂带来的误差。

病毒感染细胞后，细胞状态不良可能会造成无法产生或者产生很少的EGFP，从而无法指示阳性结果，造成一定比例假阴性，采用荧光显微镜计数法无法避免这种误差，会造成结果偏离；而本研究的数学模型中引入参数A，可将此误差校正，而结果判定由B决定，避免了对结果的影响。同时，A的值在理论上应该接近于实验的平台期感染率，例如本研究结果中，感染率为70%左右出现平台，而A约为0.74，说明了感染率不能在100%左右出现平台是因为存在假阴性。此外，如果A的值大于1，可能是因为消化细胞时间过长，导致大细胞碎片过多或者是因为培养时间过长，病毒的子代已经感染其他细胞而产生EGFP，此时样品应重新进行检测。

综上，本项研究以RSV-EGFP为研究对象，通过建立以泊松分布为基础的数学模型，研究建立了流式细胞术检测其感染滴度的方法，结果表明该方法操作简便、客观性强、精密度高。该研究不仅适用于RSV-EGFP，同样可以拓展应用于其他RSV毒株（A2株、B株、LONG株以及临床分离株）感染滴度的测定。如果病毒自身不具备指示基因，则可以通过引入荧光抗体染色指示阳性结果。其次，对于腺病毒、流感病毒等其他病毒，可以尝试采用相同的模式进行感染滴度检测法的建立。若能通过分子生物学技术方法优化阻断子一代病毒感染其他细胞，则该数学模型会更加适用。

作者

杨欣宇1,4 唐悦1,4 彭诗浛1,4 李铎2,4 王栋3,4 卢亚奇1,4 王宇1,4 陈玥如1,4 王婉1,4 李雄雄1,4

1兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室，甘肃省疫苗技术创新中心，兰州 730046；2兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室，甘肃省疫苗技术创新中心，兰州 730046；3兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗三室，甘肃省疫苗技术创新中心，兰州 730046；4中国生物技术股份有限公司，新发传染病新型疫苗研发全国重点实验室，北京，100024

通信作者：李雄雄，

Email：lixx985@163.com

引用本文：杨欣宇, 唐悦, 彭诗浛, 等.基于泊松分布模型的荧光重组呼吸道合胞病毒感染滴度测定[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(3): 180-185.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241120-00081

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