Puromycin（嘌呤霉素）是一种由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）产生的氨基核苷类抗生素，Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）也是一种常用的蛋白质合成抑制剂，多用于转染筛选、蛋白翻译研究、动物造模等实验。
一、Puromycin(嘌呤霉素)的作用机制
在细胞内，蛋白质的合成是一个极其复杂且高度有序的过程，而Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）就如同一个“捣乱分子”可以干扰这一关键进程。它的作用靶点主要是核糖体，通过模拟氨酰化tRNA（aa-tRNA）的3'末端结构，巧妙地混入蛋白质合成的“生产线”中。正常情况下，氨酰化tRNA携带特定的氨基酸进入核糖体的A位点，参与肽链的延伸。而嘌呤霉素由于其结构与氨酰化tRNA的3'末端极为相似，能够以假乱真，代替正常的氨基酸进入核糖体。一旦Puromycin（嘌呤霉素）进入核糖体的A位点，核糖体肽基转移酶中心（PTC）就会将其催化掺入到新生肽链的C末端。然而，嘌呤霉素毕竟不是真正的氨基酸，它无法像正常的氨酰化tRNA那样参与后续的肽链延伸反应。这就如同在一条生产线上，突然混入了一个不符合标准的零件，导致整个生产流程被迫中断，翻译过程过早终止[1]。
图1. Puromycin的作用机理[1]
二、应用领域
1.抗性筛选
细胞转染是指将外源核酸（如DNA、RNA等）导入真核细胞内的过程。科研人员通常可将含有抗嘌呤霉素的基因（如pac基因，编码嘌呤霉素N-酰转移酶）的载体与目的基因重组后转入宿主细胞中。pac可乙酰化Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637），使其失去对蛋白质合成的抑制活性，从而赋予细胞对嘌呤霉素的抗性。通过在细胞培养基中加入Puromycin，实验人员可以通过筛选获得成功转染的细胞。在具体操作中需进行预实验以确定最佳筛选浓度。
2.蛋白质翻译研究
翻译水平的调节是重要的基因表达调控机制之一，涉及mRNA翻译因子、核糖体蛋白、RNA结合蛋白和非编码RNA的表达以及、和选择的调节变化。Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）是一种研究蛋白翻译的重要工具，当在细胞培养体系中以低浓度加入嘌呤霉素时，它能够特异性地掺入到新合成的肽链中。这一过程就像是给上述肽链贴上了一个特殊的“标签”，科研人员可以通过追踪这个“标签”来了解蛋白质合成的动态过程，通过可以特异性识别Puromycin的抗体进行免疫印记和免疫荧光等方式检测蛋白翻译的动态过程。此外，基于嘌呤霉素的检测与邻位连接（PLA） 检测的结合（Puro-PLA），实验人员可以检测特异性mRNA的翻译。Puro-PLA：目的蛋白抗体和Puromycin的抗体各带有一段可以互补的核苷酸序列，当Puromycin作用于目的肽链上时，与目的蛋白的新生肽链间距较近，随后加入上述两种抗体，此时上述的两段核苷酸就会互补配对，随后通过滚环扩增（RCA）产生可检测的信号。
图2. Puro-PLA的工作原理
3.构建动物肾病模型
Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）在构建动物模型，尤其是肾病模型方面，有着重要的应用。以构建肾病动物模型为例，嘌呤霉素能够直接损伤肾小球上皮细胞。当给实验动物（如大鼠）注射嘌呤霉素后，它会作用于肾小球上皮细胞，使细胞骨架、细胞外基质蛋白、细胞表面整合素、硫酸化蛋白聚糖等物质发生结构和功能变化。同时，嘌呤霉素还会诱导肾小球固有细胞产生自由基，这些自由基会进一步破坏肾小球滤过膜，导致肾小球滤过膜的分子屏障功能降低。因此嘌呤霉素是一款经典的动物肾病实验造模剂[2]。
三、范例详解
1.Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis.
科研人员构建了一个荧光素酶（Gluc） 报告基因检测系统，以从中药配方SNS中鉴定具有抗I型IFN活性的成分。并在RAW264.7细胞中，采用实时PCR（RT-PCR） 和Western blotting研究I型IFN通路的变化。此外，在博来霉素（BLM，AbMole，M13641）诱导的小鼠硬化症模型中，通过RT-PCR测量纤维化基因、I型IFN相关基因、炎性细胞因子的表达，并通过H&E染色、Masson染色和免疫组织化学分析确定组织病理学变化。最终结果表明芍药总葡萄糖苷 （TGP） 是SNS的生物活性成分，它选择性抑制TLR3介导的I型IFN反应并阻断I型IFN诱导的下游JAK-STAT信号通路。在动物实验中，TGP通过抑制I型IFN信号传导上游和下游的多个靶点来改善皮肤纤维化。在构建荧光素酶检测系统中，科研人员使用了由AbMole提供的Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）用于细胞转染后的筛选[3]。
图3. Establishment of Gluc reporter assay system and identification ofingredients with anti-type I IFN activities[3].
2.Transl Oncol. 2023 Feb;28:101617.
科研人员在上述文章中探究了结直肠癌（CRC）对奥沙利铂（Oxaliplatin，AbMole，M2290）产生耐受性的机制，在实验中发现了KIAA1199可以促进CRC的奥沙利铂耐药。从机制上讲，KIAA1199可以通过连接O-GlcNAc转移酶（OGT）和底物蛋白来促进蛋白质的O-GlcNAcylation，进而可减轻内质网应激 （ERS） 并防止CRC细胞凋亡。同时，KIAA1199还可以通过O-GlcNAcylation稳定SNAI1蛋白来触发上皮间充质转化，促进CRC的转移。在实验设计中，科研人员还构建了KIAA1199和OGT敲低的稳定转染SW480和HCT116细胞，在筛选中使用了来自AbMole的Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）[4]。
图4. Inhibition of PARP1 by olaparib reverses oxaliplatin resistance of CRC[4].
参考文献及鸣谢
[1] D. Zhang, Y. Gao, L. Zhu, et al., Advances and opportunities in methods to study protein translation - A review, Int J Biol Macromol 259(Pt 1) (2024) 129150.
[2] M. Xiao, B. N. Bohnert, F. Grahammer, et al., Rodent models to study sodium retention in experimental nephrotic syndrome, Acta physiologica (Oxford, England) 235(3) (2022) e13844.
[3] M. Wang, Y. Bai, D. Jiang, et al., A novel HOIP frameshift variant alleviates NF-kappaB signalling and sensitizes cells to TNF-induced death, Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease 1870(7) (2024) 167355.
[4] Q. Hua, Y. Lu, D. Wang, et al., KIAA1199 promotes oxaliplatin resistance and epithelial mesenchymal transition of colorectal cancer via protein O-GlcNAcylation, Translational oncology 28 (2023) 101617.
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