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01
Introduction
氧化应激被认为是与肥胖、慢性肺阻塞、非酒精性脂肪肝等人类病理过程高度相关的关键因素之一。氧化应激下活性氧（ROS）的过量产生可破坏抗氧化防御系统。因此，蛋白质、脂质和DNA等细胞大分子受损，氧化应激可能导致细胞功能紊乱并加速疾病的发生。因此，开发抗氧化应激的方法并保持氧化平衡对人类健康至关重要。
近年来，口服膳食补充剂在安全、持久地维持机体氧化平衡方面受到越来越多的关注。虾青素（axanthin，AXT）作为一种重要的营养物质，已被证明具有良好的抗氧化活性和保健作用等多种功能特性。据报道，AXT的抗氧化活性大约是VE的1000倍，是茶多酚的200倍。关于AXT减轻氧化损伤已经做了很多工作，添加AXT作为膳食补充剂对于维持氧化平衡和改善人体健康具有现实意义。遗憾的是，双键的存在使AXT极不稳定，容易受到光、热和氧气的影响，限制了其应用。因此，迫切需要找到一种有效的方法来保护AXT免受恶劣环境的影响并增强其抗氧化活性。
目前，纳米载体被认为是封装和保护AXT的一种很有前途的工具，例如Pickering乳液、囊泡和纳米颗粒。AXT封装方法可以促进AXT的稳定性并提高细胞摄取效率。然而，传统的纳米载体无法实现靶向递送和控释，这进一步限制了AXT的生物利用度。基于此，已经提出了特定的面向细胞器的递送系统进行精确递送，以进一步提高生物可及性，并最终增强治疗效果。线粒体作为一种必需的细胞器，是产生能量的结构，是细胞内有氧呼吸的主要场所，被认为是各种疾病的治疗靶细胞器。结果表明，线粒体靶向纳米载体有望成为疾病干预的重要方式。
在本研究中，制备了线粒体靶向的AXT纳米颗粒，并使用代谢组学分析评价了抗氧化功效。以三苯基溴化膦（TPP）为线粒体靶向分子，通过乳清蛋白分离物（WPI）-葡聚糖（DX）偶联物的自组装制备新型线粒体靶向纳米颗粒。荧光共定位成像用于证明这种新型纳米载体的线粒体靶向能力。通过测量细胞活力、抗氧化相关指标、糖酵解中的主要限速酶活性和细胞代谢产物来评估AXT纳米颗粒对H2O2诱导的氧化损伤的影响。我们的研究结果为线粒体靶向AXT纳米颗粒的抗氧化功效提供了综合评价，在营养补充剂和疾病干预方面具有潜在的应用前景。
02
Results and Discussion
TWD-AXT纳米粒子的线粒体靶向能力
TWD-AXT纳米粒子通过负载AXT后，由TPP修饰的WPI-DX自组装构建而成（图1A）。如图1B所示，TWD-AXT纳米粒子分散性良好，呈近球形，粒径约为190 nm（图1C）。为评估TWD-AXT纳米粒子的线粒体靶向能力，本研究采用荧光探针C6（绿色荧光）替代AXT制备TWD-C6纳米粒子。由于线粒体红色荧光染料Mito-tracker与探针C6的绿色荧光叠加，观察到橙色荧光，表明纳米粒子与线粒体共定位。如图1D所示，孵育4 h后，游离C6组和WD-C6组仅观察到微弱橙色荧光，而TWD-C6组则呈现显著橙色荧光。此外，Pearson相关系数（r）结果显示，TWD-C6组的r值（0.88）明显高于游离C6组（0.53）和WD-C6组（0.67）。综上，这些结果表明TPP修饰可显著增强TWD载体的线粒体靶向能力。
图1（A）线粒体靶向AXT纳米粒子的制备示意图；（B）TWD-AXT纳米粒子的冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）图像及（C）粒径分布；（D）以游离C6和WD-C6为对照，通过荧光分析评估TWD-C6的线粒体共定位能力（EDC/NHS作为催化剂）
细胞活力分析
采用CCK-8法评估WD-AXT和TWD-AXT处理后细胞的存活率。如图2A-B所示，随着WD-AXT或TWD-AXT浓度（0～20 μg/mL）的增加，细胞活力呈剂量依赖性上升。当AXT浓度为20 μg/mL时，WD-AXT和TWD-AXT组的细胞活力分别达到最高值（114.23%和121.62%），表明AXT具有促进细胞增殖的作用。然而，当AXT浓度升至40 μg/mL时，WD-AXT和TWD-AXT组的细胞活力分别降至98.24%和96.48%，说明高浓度AXT对细胞生长具有一定抑制作用。如图2C所示，当H₂O₂浓度为400 μmol/L时，细胞活力降至85.42%，而在800 μmol/L时则急剧下降，证实H₂O₂可诱导严重的细胞氧化损伤。因此，后续实验选用400 μmol/L H₂O₂作为处理浓度。图2D-E显示，与H₂O₂组相比，WD-AXT和TWD-AXT的加入可显著提高H₂O₂处理的RAW264.7细胞活力，表明AXT递送系统能够缓解H₂O₂诱导的细胞毒性。值得注意的是，在相同处理条件（AXT 20 μg/mL，H₂O₂ 400 μmol/L）下，TWD-AXT预处理组的RAW264.7细胞活力（91.82%）高于WD-AXT组（88.21%）。这是由于TPP修饰的TWD-AXT纳米粒子更易被细胞内化并在线粒体中富集，从而实现靶向递送并提升AXT的生物利用度。Zhang等利用超声自乳化纳米载体构建的线粒体靶向AXT递送系统也报道了类似结果。
图2 RAW264.7细胞分别与（A）WD-AXT、（B）TWD-AXT及（C）H₂O₂共孵育24 h后的细胞活力。（D）WD-AXT和（E）TWD-AXT对H₂O₂诱导的细胞活力的影响
SOD、CAT、GSH及MDA水平分析
超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）是人体内关键的抗氧化酶，可有效清除过量氧自由基以维持细胞活性。如图3A-B所示，与对照组相比，H₂O₂组的SOD和CAT水平分别降低了63.53%和66.75%。经WD-AXT和TWD-AXT预处理后再加入H₂O₂的RAW264.7细胞中，SOD与CAT活性均显著回升，其中TWD-AXT组提升尤为显著。谷胱甘肽（GSH）水平的变化趋势与SOD、CAT一致（图3C）。值得注意的是，TWD-AXT组的GSH含量较WD-AXT组显著增加（P＜0.05）。丙二醛（MDA）作为脂质氧化的终产物，可反映机体的氧化损伤程度。如图3D所示，H₂O₂组的MDA含量较对照组显著升高（达3.58倍），表明细胞发生严重氧化损伤。与H₂O₂组相比，WD-AXT和TWD-AXT组的MDA水平分别降低48.83%和54.59%（P＜0.01），且TWD-AXT组的MDA含量较WD-AXT组进一步显著下降（P＜0.05）。综上，相较于WD-AXT，线粒体靶向的TWD-AXT纳米粒子能更有效缓解H₂O₂诱导的细胞氧化应激。
图3 RAW264.7细胞在（对照组）及经H₂O₂、WD-AXT（WD-AXT + H₂O₂）和TWD-AXT（TWD-AXT + H₂O₂）处理后（A）SOD、（B）CAT、（C）GSH及（D）MDA的水平变化
抗氧化相关酶mRNA表达分析
如图4A-E所示，与对照组相比，H₂O₂组的SOD1、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、NAD(P)H:醌氧化还原酶1（NQO1）及血红素加氧酶1（HO-1）的mRNA表达均显著降低。经WD-AXT和TWD-AXT干预后，上述抗氧化相关酶的基因表达水平均显著回升，表明AXT纳米粒子可改善氧化应激状态下抗氧化酶的基因表达。核因子E2相关因子2（Nrf-2）是调控抗氧化应激的关键转录因子。在氧化应激条件下，Nrf-2可转位至细胞核内，激活抗氧化相关酶信号通路，从而降低氧化应激水平。如图4F所示，与H₂O₂组相比，WD-AXT和TWD-AXT组的Nrf-2 mRNA表达均显著增加，其中TWD-AXT组的表达量较H₂O₂组提升28.25%。综上，AXT纳米粒子可能通过激活Nrf-2通路，上调其mRNA表达以缓解氧化损伤。AXT纳米颗粒的作用也应在酶水平上得到证实。
图4（A）SOD1、（B）CAT、（C）GSH-Px、（D）NQO1、（E）HO-1及（F）Nrf-2在对照组及经H₂O₂、WD-AXT（WD-AXT + H₂O₂）和TWD-AXT（TWD-AXT + H₂O₂）处理后的mRNA表达水平
TWD-AXT对糖酵解关键酶的影响
糖酵解途径中葡萄糖转化为丙酮酸需经历十步化学反应，每一步均由特定酶催化。其中有三步反应不可逆，分别由己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸激酶（PK）催化。HK催化糖酵解途径的第一个关键步骤，将葡萄糖转化为6-磷酸果糖；PFK催化第二个关键步骤，作为糖酵解的限速反应，将6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖；PK则催化第三个关键步骤，将磷酸烯醇式丙酮酸转化为烯醇式丙酮酸。如图5所示，与对照组相比，H₂O₂使HK、PFK和PK的活性分别降低60.21%、38.19%和68.24%，导致细胞能量供应不足、活力下降。经WD-AXT和TWD-AXT干预后，这三种酶的活性均显著提高，其中TWD-AXT组的提升效果显著高于WD-AXT组（P＜0.05）。结果表明，AXT纳米粒子可有效缓解H₂O₂引起的糖酵解关键酶活性抑制，从而改善细胞活力。
图5（A）HK、（B）PFK及（C）PK在对照组及经H₂O₂、WD-AXT（WD-AXT + H₂O₂）和TWD-AXT（TWD-AXT + H₂O₂）处理后的酶活性变化
TWD-AXT对代谢谱的影响
进一步通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）解析各组代谢差异。如图6A所示，WD-AXT + H₂O₂组的代谢谱与对照组和H₂O₂组明显分离。模型参数Q²＝0.732、R²＝0.846，显示良好的预测能力与解释度。置换检验（n＝200）中R²和Q²的截距值均低于原模型，证实模型稳定性（图6B）。载荷图（图6C）进一步显示不同处理组代谢物变化存在显著差异。类似结果也见于对照组、H₂O₂组与TWD-AXT + H₂O₂组的PLS-DA分析（图6D-F）。
图6以未处理细胞为对照，采用代谢组学分析WD-AXT或TWD-AXT处理后添加H₂O₂的RAW264.7细胞
TWD-AXT对氨基酸代谢的影响
氨基酸作为蛋白质基本组成单位，在能量代谢中具有不可替代的作用。如图7所示，H₂O₂处理导致氨基酸代谢紊乱。组氨酸是一种极其重要的氨基酸，在抗氧化过程中发挥关键作用。对照组相比，H₂O₂组的组氨酸含量降低32.76%，表明细胞遭受了氧化损伤。经纳米粒子干预后，组氨酸水平升高，尤其是TWD-AXT+H₂O₂组较H₂O₂组升高了16.28%，表明TWD-AXT能够缓解H₂O₂处理的RAW264.7细胞的氧化应激。丙氨酸是糖酵解的中间产物，参与葡萄糖-丙氨酸循环。丙氨酸水平的变化趋势与组氨酸相似。甲硫氨酸在谷胱甘肽生物合成途径中起重要作用。H₂O₂组的甲硫氨酸水平较对照组降低，而经WD-AXT和TWD-AXT干预后分别升高至H₂O₂组的1.48和1.56倍。此外，氨基酸中间体如莽草酸和犬尿烯酸等在H₂O₂处理后水平下调，而TWD-AXT+H₂O₂组中这些氨基酸的水平得到缓解。这些结果进一步证实了氨基酸代谢紊乱的存在，而TWD-AXT能够缓解H₂O₂处理的RAW264.7细胞的这一现象。
TWD-AXT对能量代谢的影响
细胞能量代谢是所有生命体不可或缺的代谢途径。如图7所示，经H₂O₂处理后，包括糖酵解、三羧酸（TCA）循环、烟酸及烟酰胺代谢在内的能量代谢通路均出现明显紊乱。与对照组相比，H₂O₂组的6-磷酸葡萄糖和1,6-二磷酸果糖水平分别降低51.26%和68.24%。经TWD-AXT干预后，这两种代谢物水平均有所回升。该结果与糖酵解限速酶的检测结果一致。此外，作为乙酰辅酶A合成的直接碳前体，丙酮酸在TCA循环中也发挥重要作用。H₂O₂组的丙酮酸水平较对照组降低49.32%，经TWD-AXT处理后回升35.65%。这些结果表明糖酵解过程受到干扰，而TWD-AXT能够缓解H₂O₂诱导的RAW264.7细胞糖代谢紊乱。
TCA循环通过提供能量和构建单元参与生理过程，维持细胞存活。与对照组相比，H₂O₂处理后柠檬酸水平显著降低。相反，经TWD-AXT预处理后再暴露于H₂O₂的RAW264.7细胞中，柠檬酸水平是H₂O₂组的1.46倍，表明TWD-AXT对氧化损伤具有干预作用。与柠檬酸类似，TCA循环中的其他代谢物如草酰乙酸和苹果酸也呈现相同变化趋势。值得注意的是，H₂O₂组的烟酸和烟酰胺代谢也出现下调，而TWD-AXT处理可使H₂O₂处理的RAW264.7细胞中这些代谢通路上调。烟酸代谢可生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的前体烟酰胺，后者通过调节能量代谢来预防氧化损伤。这些结果表明TWD-AXT可通过调节糖酵解、TCA循环以及烟酸和烟酰胺代谢来缓解H₂O₂诱导的能量代谢紊乱。
为更全面评估TWD-AXT对能量代谢的影响，通过监测氧消耗速率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）值的变化进行线粒体呼吸测试和糖酵解压力测试。正常细胞通过糖酵解将葡萄糖代谢为丙酮酸，后者进入线粒体参与TCA循环。在此过程中，氧化磷酸化（OXPHOS）产生ATP。然而当线粒体功能紊乱时，细胞需要通过增强糖酵解活性来维持能量供应。
03
Conclusion
本研究成功制备了线粒体靶向AXT纳米粒子并评估其抗氧化功效。该新型纳米粒子呈球形，具有优异的线粒体靶向能力。体外研究表明，线粒体靶向AXT纳米粒子可提高细胞活力并增强抗氧化酶活性。重要的是，代谢组学分析表明线粒体靶向AXT纳米粒子可通过调节氨基酸代谢和能量代谢来缓解氧化应激。综上，所有结果证实线粒体靶向AXT纳米粒子具有强效抗氧化作用，能有效缓解H₂O₂处理的RAW264.7细胞的氧化应激。这种新型线粒体靶向AXT纳米粒子在营养补充剂和疾病干预领域具有广阔应用前景。
Mitochondria-targeted nanoparticles for encapsulating astaxanthin: exploring the reason for alleviating oxidative damage
Yannan Chena,b,c, Siyuan Feia,b,c, Lijuan Zhanga,b,c, Mingqian Tana,b,c,*
a Academy of Food Interdisciplinary Science, School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China
b National Engineering Research Center of Seafood, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China
c Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China
*Corresponding author.
Abstract
Oxidative stress is considered as a critical factor in the process of pathological diseases, and mitochondria are considered as vital target organelles for disease intervention. The purpose of this study was aimed to evaluate the antioxidant efficacy of mitochondria-targeted astaxanthin nanoparticle on hydrogen peroxide-induced oxidative damage. As expected, mitochondria-targeted nanoparticle showed excellent mitochondria co-localization ability with higher Pearson’s correlation coefficient (r = 0.88). In vitro experiments suggested that the mitochondria-targeted astaxanthin nanoparticle could promote cell viability and increase antioxidant-related enzyme activities. Simultaneously, metabolomics analysis indicated that mitochondria-targeted astaxanthin nanoparticle could alleviate oxidative stress by regulating amino acid metabolism and energy metabolism. Altogether, all these results strongly confirmed the mitochondria-targeted strategy for astaxanthin delivery could relieve oxidative stress and had great promise in the application of disease intervention.
Reference:
CHEN Y N, FEI S Y, ZHANG L J, et al. Mitochondria-targeted nanoparticles for encapsulating astaxanthin: exploring the reason for alleviating oxidative damage[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(1): 9250080. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250080.
翻译：陈文静（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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