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Part.01

Introduction

血脂异常，特别是血浆胆固醇水平升高，与心血管疾病和中风风险增加有关。虽然胆固醇可以在我们身体的几乎所有细胞中产生，但肝细胞和肠道细胞是内源性胆固醇合成的主要贡献者，其受胆汁酸（BAs）受体和信号通路的调节。BA受体参与BA合成和肠肝循环。位于肝脏和肠道中的法尼醇X受体（FXR）通过BAs激活导致肝脏中Cyp7a1的抑制和BA合成的下调。肠道微生物产生的胆盐水解酶（BSH）在结合BAs的水解中起着关键作用，并且已被确定为调节BA代谢的关键靶标。在这项研究中，揭示了石榴皮苷抑制肝脏胆固醇生物合成、促进BAs合成并减少BAs重吸收，从而促进胆固醇降低。BAs代谢组学分析和16S rRNA基因测序分析表明，石榴皮苷促进了初级BAs向次级BAs的转化，并减少了BSH产生菌的丰度。石榴皮苷抑制肠道FXR-Fgf15信号传导并促进肝脏FXR-SHP信号传导。

Part.02

Results and Discussion

石榴皮苷减少了HFHC饮食诱导的小鼠高胆固醇血症

为了评估石榴皮苷对高胆固醇血症的影响，对小鼠进行了为期6周的HFHC饮食，并使用或不使用石榴皮苷进行评估，并评估了血清胆固醇水平。HFHC喂养的小鼠中血清TC，LDL-C和TC与HDL-C的比率（TC/HDL-C）的水平显著升高，而HDL-C的水平降低（图1）。石榴皮苷使HFHC饮食小鼠的血清TC（图1A），LDL-C（图1B），TC/HDL-C（图1C）的水平分别降低了33.9％，27.6％和49.4％。这些结果表明，石榴皮苷在HFHC饮食喂养的小鼠中具有抗高胆固醇血症作用。

石榴皮苷减轻了HFHC饮食喂养小鼠的肝损伤和葡萄糖不耐受

与饲喂正常饮食的小鼠相比，饲喂HFHC饮食的小鼠的肝脏指数（图2A）和肝脏TC（图2B）显著增加。石榴皮苷给药显著降低了肝脏指数以及肝脏TC和NEFA的水平（图2A-C）。此外，HFHC组小鼠的肝脏ALT水平升高（图2D）。H＆E染色显示，免疫细胞浸润（黄色箭头），肝细胞体积增大，肝细胞胞质透明（蓝色箭头）和HFHC饮食喂养的小鼠肝细胞核漂浮在肝细胞中心（图2E）。石榴皮苷的补充大大改善了这些症状。此外，HFHC组小鼠的粪便胆固醇含量与石榴皮苷补充组没有显著差异（图2F）。与饲喂HFHC饮食的小鼠相比，用石榴皮苷治疗的小鼠显示出较低的空腹血糖水平（图2G），并且由于石榴皮苷治疗组中用于小鼠的血浆葡萄糖反应曲线下的面积显著小于HFHC饮食喂养的小鼠，因此改善了葡萄糖耐受性（图2H）。这些发现表明，通过石榴皮苷给药可改善肝损伤和葡萄糖不耐受。

石榴皮苷降低了回肠中胆固醇的吸收并改变了肝脏中的胆固醇代谢

RT-qPCR测定显示，与HFHC饮食喂养的小鼠相比，石榴皮苷治疗的小鼠中两种主要的胆固醇生成酶（Fdps和Cyp51）的转录水平较低（图3A）。还测量了胆固醇外排基因（Abcal，Abcg5和Abcg8）和脂肪酸合成基因（Spp1，Acc1和Acc2）的转录水平，石榴皮苷对这些基因的表达几乎没有影响（图3A）。HFHC喂养的小鼠表现出LXR的表达减少，而石榴皮苷给药上调了LXR的表达（图3B）。此外，发现LDL-R是一种有助于胆固醇从血清转运到肝脏的LDL受体，在石榴皮苷治疗的小鼠的肝脏中上调（图3C）。如图3D所示，与HFHC饮食喂养的小鼠相比，在石榴皮苷治疗的小鼠的肝脏中，Cyp51和Fdps的蛋白质表达显著降低，而LXR蛋白的表达在石榴皮苷干预后显著上调（图3D）。但是，在HFHC和HFHC + PU组小鼠之间，LDL-R的表达没有显著差异（图3D）。此外，与正常组相比，HFHC组中肠道脂质吸收转运蛋白相关基因表达的差异显著增加（图3E）。用石榴皮苷处理可显著降低肠道脂质吸收相关基因的表达，包括CD36和Niemann-Pick C1 like protein 1（Npc111）（图3E-F）。总而言之，这些结果表明，石榴皮苷的给药可能通过调节与胆固醇代谢相关的基因的表达，抑制肝脏胆固醇生物合成和肠道胆固醇吸收来降低血清胆固醇水平。

石榴皮苷调节BA合成

BA合成是肝脏胆固醇分解代谢的主要途径。与HFHC喂养的小鼠相比，石榴皮苷给药组中小鼠肝脏和血清中的TBA水平较低（图4A-B）。可以通过两种方式产生BAs。在这项研究中，在饲喂HFHC饮食的小鼠中，经典肝BA合成途径中的限速酶Cyp7a1和替代合成途径的关键酶Cyp27a1的mRNA水平显著降低（图4C）。在补充石榴皮苷的小鼠的肝脏中，Cyp7a1和Cyp27a1的mRNA和蛋白质显著增加，而TBA含量降低（图4A，C，D）。与HFHC饮食喂养的小鼠相比，石榴皮苷治疗的小鼠中粪便中的TBA含量更高（图4E）。此外，回肠中ASBT的mRNA表达在石榴皮苷治疗的小鼠中降低（图4F）。通过蛋白质印迹法（图4G），HFHC + PU组中小鼠中ASBT的蛋白质表达也降低。

石榴皮苷调节对HFHC饮食有反应的BA丰度和组成

接下来，使用LC-MS研究了石榴皮苷对小鼠粪便中BA物种的丰度和组成的影响。与HFHC饮食喂养的小鼠相比，石榴皮苷治疗的小鼠粪便中具有更高的BA水平和不同的BA组成（图5A）。在来自实验组的小鼠的粪便中的BA组成谱上，进行了正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。OPLS-DA散点图清楚地辨别了不同组（图5B），表明HFHC饮食和石榴皮苷的补充显著改变了BA的组成。

石榴皮苷调节肝脏和回肠中的FXR信号通路

SHP和Fgf15是FXR的靶标，在石榴皮苷治疗的小鼠中上调，表明石榴皮苷可以激活肝FXR/SHP/Fgf15信号通路（图6A，C）。有趣的是，在用石榴皮苷治疗的小鼠的回肠中，FXR和Fgf15的mRNA和蛋白质表达下调（图6B，C），这也在培养的结肠上皮细胞中得到了验证。用GW4064（一种FXR激动剂）有或没有石榴皮苷共同处理Caco2细胞。结果表明，石榴皮苷可以抑制Caco2细胞中FXR的表达（图6D-E）。总之，这些结果表明石榴皮苷可以激活肝脏FXR信号，同时抑制肠道FXR信号。

石榴皮苷调节HFHC饮食诱导的小鼠的肠道微生物群组成

通过进行16S rRNA基因测序来评估小鼠中微生物群落的分类组成和多样性。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示，三组中的微生物群形成了显著不同的簇（图7A），表明石榴皮苷的补充可以显著改变HFHC饮食诱导的肠道微生物群组成。石榴皮苷可以增加肠道微生物群落的丰富度和多样性（图7B-C）。石榴皮苷补充小鼠的特征是主要肠道细菌群落发生了变化。如图7D所示，HFHC组中前3个最丰富的门是厚壁菌门（85.75％），放线菌门（6.10％）和变形菌门（5.62％）。但是，HFHC + PU组中的这些门分别是厚壁菌门（78.95％），疣微菌门（13.79％）和放线菌门（4.04％）。与正常组相比，在门中厚壁菌门与拟杆菌门的比率在HFHC饮食喂养小鼠中富集（图7E）。分析结果表明，粘液真杆菌门细菌在石榴皮苷干预中显著富集（图7E）。与正常组相比，变形菌门中的细菌通过HFHC饮食喂养富集，并在补充石榴皮苷的小鼠中耗尽（图7E）。然后，分析了各组中科级细菌类群的相对丰度（图7F）。在石榴皮苷干预组中发现，粘液真杆菌科的相对丰度显著高于正常组和HFHC组（图7G）。此外，观察到HFHC小鼠中梭菌科和双歧杆菌科的相对丰度显著变化（图7G）。

粪便BA与微生物群落结构之间的相关性分析

进行相关性分析，以确定门水平的细菌丰度与血清TC，血清LDL-C，血清TBA，肝脏TBA和粪便BA代谢物（图8A）。观察到，血清LDL-C，血清TBA，肝脏TBA和初级BAs（TCA，TCDCA和GCA）与变形菌门显著正相关，变形菌门在HFHC喂养小鼠的粪便样品中富集。次级BAs（DHLCA和3β-UDCA）与厚壁菌门和放线菌门显著正相关。BSH产生细菌Clostridium_sense_stricto_1与次级BA（GLCA）显著负相关，与初级BAs（TCA，TCDCA，GCA和CDCA）显著正相关，双歧杆菌与次级BA（HDCA，isoLCA和GLCA）显著负相关，与初级BAs（GCA和NorCA）显著正相关。Turicibacter和Lachnospiraceae_NK4A136_group与次级BA（GHLCA和3β-UDCA）显著负相关，与初级BAs（CDCA和TCA）显著正相关。这些结果进一步表明，肠道微生物群参与了胆固醇代谢和BA代谢。

Part.03

Conclusion

总之，本研究证明石榴皮苷可以通过减少胆固醇的生物合成并促进肝脏胆固醇转化为BA来减轻高胆固醇血症。石榴皮苷的降胆固醇作用可以归因于其调节肠道微生物群，改变BA组成和调节FXR信号通路的能力。这些发现表明，开发基于石榴皮苷的药物作为预防和减轻高胆固醇血症的替代或辅助策略具有潜在的应用价值。

Punicalagin alleviates hypercholesterolemia in mice through modulating farnesoid X receptor signaling and modulating gut microbiota

Huanhuan Liua, Hongli Liua, Chunhong Yana, Jiaxiu Liua, Yu Caoa,b, Guopeng Lia, Xiaodong Xiaa,*

a State Key Laboratory of Marine Food Processing and Safety Control, National Engineering Research Center of Seafood, School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

b Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

*Corresponding author.

Abstract

Punicalagin has been demonstrated to exhibit anti-oxidant and anti-infl ammatory properties, but whether and how it could impact hypercholesterolemia remains not fully explored. The aim of this study was to investigate the influence of punicalagin on hypercholesterolemia in mice and its related mechanisms. After 6 weeks’ intervention, punicalagin significantly reduced serum total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) levels in mice fed a high-fat high-cholesterol (HFHC) diet. Meanwhile, punicalagin supplementation lowered hepatic cholesterol level, which corresponded to the down-regulation of cholesterol synthesis genes (Fdps, Cyp51) and up-regulated bile acid synthesis genes (Cyp7a1, Cyp27a1). In addition, bile acid reabsorption was retarded in punicalagin-fed mice through down-regulating ileal apical sodium-dependent BA transporter (ASBT). Furthermore, i ntestinal farnesoid X receptor (FXR)-fibroblast growth factor 15 (Fgf15) pathway was inhibited while hepatic FXR-small heterodimeric partner (SHP) pathway was activated in punicalagin group. M icrobiota analysis and targeted metabolomics showed that p unicalagin decreased the abundance of bile-salt hydrolase (BSH)-producing bacteria (Clostridiaceae and Bifidobacteriaceae) and the ratio of primary BAs to secondary BAs. In conclusion, the cholesterol-lowering effect of punicalagin partly through down-regulating cholesterol synthesis and increasing cholesterol catabolism, which could be achieved by regulating gut microbiota, altering bile acid composition and modulating FXR signaling pathway. T hese findings indicate the potential application of punicalagin-related products as an alternative strategy for hypercholesterolemia prevention and mitigation.

Reference:

LIU H H, LIU H L, YAN C H, et al. Punicalagin alleviates hypercholesterolemia in mice through modulating farnesoid X receptor signaling and modulating gut microbiota[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(1): 9250012. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250012.

翻译：管勤昊（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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