逆行示踪技术是一种神经科学研究方法，用于逆向追踪神经元的连接路径。简单来说，它就像给神经元的“输出端”（轴突末梢）贴上一个可追踪的标签，然后观察这个标签如何沿着轴突“逆流而上”，最终回到神经元的胞体。通过这种方法可以找出哪些神经元直接投射到了某个特定的脑区或目标位置。
案例解析：在小鼠下丘脑弓状核（ARC）中识别并鉴定出特异性调控能量消耗的神经元群体及其神经环路机制
1、解析Crabp1神经元的输出连接
明确下游投射靶点：Crabp1神经元是下丘脑弓状核（ARC）中一种调控能量消耗的神经元亚型，通过向潜在的下游脑区（如外侧隔核LS、终纹床核BNST、内侧视前区MPOA等）注射逆行AAV病毒，病毒会从靶点沿轴突逆向运输至ARC的Crabp1神经元胞体，从而明确Crabp1神经元主要投射到哪些脑区。
2、验证特定投射通路的功能
明确“Crabp1神经元→某靶点”的投射通路是否直接参与能量消耗的调控，排除非功能投射。
3、解析Crabp1神经元的上游输入
通过狂犬病病毒逆行追踪，解析哪些脑区的神经元会向Crabp1神经元提供输入。
逆行病毒标记技术解析Crabp1神经元的输出连接（即“哪些下游核团接收Crabp1神经元的投射”），具体实验设计与操作可分为“单靶点逆行追踪”和“多靶点交叉验证”两类方案：
病毒工具：
逆行AAV病毒（AAV2/2Retro血清型）：携带Cre依赖的报告基因（如EGFP、tdTomato、Flpo重组酶），可从投射靶点逆向感染神经元胞体（仅感染轴突末梢并逆行运输至胞体，实现从靶点定位上游神经元）。
辅助病毒：
AAV-fDIO-TeNT-mCherry（用于特异性沉默投射至某靶点的Crabp1神经元，结合Flpo-Cre双重组系统实现精准调控）。
动物模型：
Crabp1-iCre转基因小鼠（通过CRISPR构建，Crabp1启动子驱动iCre表达，仅Crabp1神经元可被Cre依赖的病毒标记）。
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具体实验方案与步骤
（1）单靶点逆行追踪：定位Crabp1神经元的下游投射靶点
目标：
明确Crabp1神经元主要投射至哪些脑区，筛选出高投射密度的核团（如LS、BNST、MPOA、PVN、LH、DMH）。
操作流程：
向Crabp1-iCre小鼠的下游候选靶点（如LH：外侧下丘脑，外侧隔核）双侧注射逆行AAV病毒（如AAV2/2Retro-hSyn-FLEX-EGFP-WPRE-pA）。向小鼠ARC脑区（Crabp1神经元胞体所在区域）注射Cre依赖的荧光报告病毒（如AAV2/9-hSyn-DIO-mCherry-WPRE-pA），用于标记Crabp1神经元胞体。
病毒表达等待期：
注射后饲养小鼠3周，确保逆行病毒从靶点（如LH）沿轴突逆向运输至ARC的Crabp1神经元胞体并充分表达报告基因（EGFP）。
组织切片与成像：
小鼠经心脏灌注（4%多聚甲醛）、脑解剖、蔗糖脱水后，制作20-40μm厚的冠状冰冻切片，通过共聚焦显微镜观察ARC区域：若Crabp1神经元（mCherry+）同时表达逆行病毒的报告基因（EGFP+），则证明该神经元可投射至目标脑区（如LH）。
定量分析：统计ARC中“mCherry+EGFP+”双阳性神经元占总Crabp1神经元（mCherry+）的比例，判断该靶点与Crabp1神经元的连接强度。
（2）多靶点交叉验证：验证“一对多”投射模式
目标：
明确单个Crabp1神经元是否通过轴突侧支同时投射至多个靶点（即“一对多”投射），而非“单个神经元仅投射至一个靶点”（一对多模式是Crabp1神经元整合调控能量消耗的结构基础）。
操作流程：
双病毒交叉注射：
向同一Crabp1-iCre小鼠的两个不同下游靶点（如“MPOA+LH”“PVN+DMH”）分别注射两种不同荧光标记的逆行AAV病毒：
靶点1（如MPOA）：注射AAV2/2Retro-hSyn-FLEX-EGFP-WPRE-pA（报告基因：EGFP，绿色荧光）。
靶点2（如LH）：注射AAV2/2Retro-hSyn-FLEX-tdTomato-WPRE-pA（报告基因：tdTomato，红色荧光）。
成像与分析：
3周后观察ARC区域的Crabp1神经元：
若出现“EGFP+tdTomato+”双阳性神经元，证明该Crabp1神经元同时投射至MPOA和LH（即轴突侧支实现多靶点覆盖）。
结果：在MPOA/LH/PVN/DMH/BNST这5个靶点间，双阳性神经元比例高达30%-50%；而LS与其他靶点间双阳性比例<5%，证明Crabp1神经元分为“Group1（主要投射LS）”和“Group2（主要投射下丘脑内多靶点）”两类。
（3）功能逆行追踪：沉默特定投射通路以验证功能
目标：
明确“Crabp1神经元→某靶点”的投射通路是否直接调控能量消耗，排除非功能投射。
操作流程：
双病毒组合策略（Flpo-Cre双重组系统）：
第一步：向下游靶点（如LH）注射Cre依赖的Flpo重组酶逆行病毒（AAV2/2Retro-CAG-FLEX-Flpo-WPRE-pA，200nL/侧）。
第二步：向ARC脑区注射Flpo依赖的突触沉默病毒（AAV2/9-hEF1a-fDIO-mCherry-P2A-TetTox-WPRE-pA，200nL/侧，TeNT可阻断突触传递）。
原理：仅投射至LH的Crabp1神经元会被逆行病毒标记Flpo，进而激活ARC中Flpo依赖的TeNT表达，实现特异性沉默Crabp1→LH通路，不影响其他投射通路。
功能检测：
沉默后监测小鼠代谢表型：通过间接测热法测能量消耗（EE）、EchoMRI测体成分、寒冷暴露测适应性产热。
结果：沉默Crabp1→LH/MPOA/PVN/DMH/BNST通路会导致体重↑15%-20%、EE↓10%-15%；而沉默Crabp1→LS通路无显著表型，证明前5条通路是调控能量消耗的功能通路。
Fig1 Crabp1神经元的输入/输出连接图谱（核心逆行追踪结果）
通过向不同下游靶点（如LS、MPOA、LH）注射两种不同荧光的逆行AAV（EGFP/tdTomato），观察ARC中Crabp1神经元的双标情况：结果显示MPOA/LH/PVN/DMH/BNST投射的Crabp1神经元存在大量重叠（双标比例30%-50%），而LS投射的神经元与其他靶点无重叠，直接证明Crabp1神经元分为“Group1（投射LS）”和“Group2（投射下丘脑内多靶点）”两类。
通过fMOST成像对稀疏标记的Crabp1神经元进行全脑投射重建，结合逆行追踪数据，量化不同脑区的轴突终端密度：结果显示Group2神经元在BNST、MPOA、PVN等核团有密集投射，而Group1仅在LS有密集投射，验证“一对多投射”模式。
L-N：通过狂犬病病毒逆行追踪解析Crabp1神经元的上游输入，发现其主要接收来自DMH、POA、PVN等核团的输入，与下游投射形成“双向回路”，为信号整合机制提供结构基础。
Fig2 定投射通路的功能验证（功能逆行追踪）
特定投射通路的功能验证（功能逆行追踪）
该Figure基于“逆行追踪+突触沉默”的组合策略，验证“Crabp1→某靶点”通路的功能必要性是逆行追踪技术的功能延伸：
A-B：展示功能逆行追踪的实验设计：向下游靶点（如LH）注射“Cre依赖的Flpo逆行病毒”，同时向ARC注射“Flpo依赖的TeNT（突触沉默病毒）”，仅投射至该靶点的Crabp1神经元会被沉默。
C：量化沉默不同投射通路后的体重变化：结果显示沉默Crabp1→BNST/MPOA/PVN/LH/DMH通路会导致体重显著增加（4周体重↑15%-20%），而沉默Crabp1→LS通路无显著变化，明确前5条通路是调控体重的功能通路。
O-P：通过荧光成像展示Crabp1→LH和Crabp1→LS通路的轴突分布差异。LH投射的Crabp1神经元在多个下丘脑核团有轴突侧支，而LS投射的神经元无跨核团侧支，进一步印证Group2神经元的“一对多”功能投射特性。
逆行病毒示踪案例总结
Crabp1神经元主要投射至6个核团，分为两类：功能靶点（Group2）：BNST、MPOA、PVN、LH、DMH，参与体温、运动与自主神经调控。非功能靶点（Group1）：LS，与能量消耗无关。首次发现Crabp1神经元通过“一对多”投射（单神经元→3-4个靶点），协同调控活动、体温与产热，突破传统“一对一”模式。结合逆行追踪与功能沉默，鉴定出关键功能通路（如Crabp1→LH），为精准干预肥胖提供新靶点。
文献引用
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.08.021
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