Mol Cell | 具有C端延伸的泛素前体通过维持蛋白质稳态促进长寿|前体|底物|泛素|线粒体|营养补充剂|蛋白质

撰文|一只鱼

泛素是一种在真核生物中高度保守的蛋白质，它通过翻译后共价修饰附着于多种底物，这种修饰对维持细胞基础功能至关重要。在不同应激条件下，泛素化修饰通过协调蛋白酶体系统（UPS）和自噬等蛋白降解质控通路，维持细胞稳态。泛素化缺陷可导致出生缺陷、儿科疾病、神经病变或癌症。泛素化过程依次由泛素激活酶（E1）、结合酶（E2）和连接酶（E3）催化。蛋白质底物可发生单泛素化、多位点单泛素化或多聚泛素化修饰，当泛素以其自身氨基酸（通常为赖氨酸）为锚点连接形成链状结构时，即产生多聚泛素化。在某些情况下，E4泛素连接酶可延伸这种E3依赖的泛素链。在应激条件下，E4连接酶活性对增强UPS介导的靶蛋白降解尤为关键。首个被发现的E4连接酶是酿酒酵母中的Ufd2，能识别带有N端泛素融合序列的报告蛋白，通过泛素融合降解（UFD）途径触发底物降解。然而在应激状态下，泛素由多聚泛素前体生成，且最终泛素分子总携带一个或多个氨基酸的C端延伸（CxUb），这种延伸的生理意义尚不清楚。

近日，来自德国科隆大学的Mafalda Escobar-Henriques研究团队在Molecular Cell上发表题为Ubiquitin precursor with C-terminal extension promotes proteostasis and longevity的文章，发现C端延伸泛素（CxUb）在酿酒酵母和秀丽隐杆线虫中对胁迫抵抗、线粒体自噬及寿命调控具有关键作用。CxUb可形成泛素链，并与泛素链延伸酶Ufd2结合，Ufd2特异性识别CxUb并将其偶联至底物蛋白，触发底物降解。

研究人员以芽殖酵母为模型探究多聚泛素基因在应激抵抗中的作用，酵母含有一个多聚泛素基因UBI4，编码五个头尾相连的泛素重复单元，他们分析了六种工程化缺失菌株（包含0-5个泛素重复单元，分别标记为0-5Ub）。缺失所有五个重复单元的Δubi4菌株（0Ub）对多种应激条件敏感，包括高温、金属离子、氨基酸类似物、低pH、放线菌酮（CHX）和雷帕霉素，而含有1-5个泛素重复单元（1-5Ub）的其余菌株在应激抵抗性上无显著差异，表明多聚泛素基因中泛素重复单元的数量并非应激抵抗的关键因素，提示未加工的线性泛素链对应激应答贡献有限。UBI4变体1-5Ub均含有一个CxUb拷贝，为评估其C端延伸的功能，他们删除了CxUb末端的天冬酰胺（N77）密码子。结果发现无论是在含五个泛素拷贝的野生型菌株还是仅含一个泛素拷贝的菌株中，仅敲除该C端天冬酰胺残基就会导致其耐热性丧失，因此酵母中UBI4依赖的应激抵抗主要依赖于CxUb。泛素与受损线粒体的结合可促进其通过线粒体自噬被自噬体捕获并清除，为了探究UBI4在线粒体自噬中的作用，他们采用成熟的碱性磷酸酶（ALP）检测法，发现UBI4缺失会损害线粒体自噬，且UBI4在线粒体自噬中的作用也依赖于CxUb。细胞与细胞器质量调控通路是多种生物健康衰老的关键决定因素，他们发现Δubi4菌株的时序寿命缩短，且UBI4-1UbΔN77也能引起等效的寿命缩短，因此CxUb是酿酒酵母中线粒体自噬和正常寿命所必需的关键因子。线虫的ubq-1编码11个串联泛素单元，其C端延伸为天冬氨酸-异亮氨酸二肽，为特异性敲除线虫的CxUb，他们利用CRISPR-Cas9将该二肽替换为两个终止密码子，获得的两株独立ΔCxUb突变株系，发现其寿命缩短。

泛素C末端的最后两个甘氨酸（G）残基（特别是G76）使泛素能够共价连接到底物蛋白上，并促进多聚泛素链的形成，他们构建了偶联缺陷型CxUb变体：将CxUb的最后两个甘氨酸残基突变为丙氨酸（G75A和G76A），和成熟缺陷CxUb变体：将亮氨酸73突变为脯氨酸（L73P），该突变可抑制所有泛素特异性加工蛋白酶对其的切割，他们将这些突变通过基因组编辑引入UBI4的最后一个泛素重复单元。结果发现与Δubi4菌株类似，偶联缺陷和成熟缺陷的CxUb变体均无法在高温下生长，且在雷帕霉素存在下也表现出线粒体自噬水平降低，因此应激抵抗和线粒体自噬需要CxUb成熟并偶联至底物。当用雷帕霉素在酵母中诱导线粒体自噬时，酵母线粒体融合蛋白Fzo1会发生蛋白酶体依赖性周转，破坏Ubi4和Ufd2会抑制线粒体自噬过程中Fzo1的周转，且Fzo1周转依赖于CxUb。接下来他们通过免疫共沉淀实验比较了Ufd2与CxUb及泛素（Ub）的结合能力，发现Ufd2-Myc与FLAG-UbN77的共沉淀信号远强于FLAG-Ub，且Ufd2的中心核心结构域足以结合UbN77，因此Ufd2优先结合CxUb而非Ub，该过程依赖其中间结构域。