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01
Introduction
柠檬精油，尤其是冷榨柠檬精油，由于天然柠檬香气在世界范围内被接受，几十年来在香精香料行业中用途广泛。此外，柠檬味的清爽和活力特性与当前自然转变饮食趋势以及全球后疫情市场形势相匹配。因此，大多数研究都集中在柠檬精油中约96%～99%的挥发性部分。柠檬油中剩余的1%～4%非挥发物长期以来一直被忽视或忽视，因为它们不被认为是独特柠檬风味的香气贡献因素。这种非挥发性组分由类胡萝卜素、脂肪酸、甾醇、香豆素和呋喃香豆素组成。香豆素和呋喃香豆素（即呋喃香豆素）称为氧杂环化合物（OHCs，图1）。
众所周知，柠檬精油的掺假很常见，因为它的需求未得到满足且成本高。掺假最典型和最常见的方法是添加较低质量的蒸馏油、洗涤油或具有独特香气的萜烯，例如柠檬醛、乙酸橙皮醇、乙酸香叶酯等。一些研究集中在对映气相色谱（GC）上或GC-燃烧-同位素比质谱法分析以确定柠檬油的真伪，但这些仪器价格昂贵、难以维护，并且通常在大多数香精香料公司和学术实验室中不可用。另一方面，非挥发性馏分，特别是OHC，在蒸馏油、萜烯和洗涤油中含量极少或不存在。在食品化学法典（FCC）中，冷榨柠檬油标准之一是在315 nm处测量其紫外线吸光度，这是OHC的最大紫外线吸光度波长。掺假者有时可以在劣质柠檬油中加入少量冷榨酸橙精油，以使掺假的柠檬油符合质量标准，因为酸橙油中的非挥发性物质含量高出约8～10倍。同时，添加冷榨酸橙精油可以改善感官评价的结果，因为它比柠檬油含有更多的醛和酯。7-甲氧香豆素、异茴芹内酯和佛手柑内酯是冷压柠檬精油中的主要OHCs，但根据文献报道，柠檬油中应不存在。
OHCs的分析因其低挥发性和热耐性而在不同的GC技术中受到限制。与GC相关技术相比，高效液相色谱（HPLC）或超高效液相色谱（UPLC）更适合此类分析。近二十年来，越来越多的研究集中在柑橘精油中的非挥发性物质上。据称有两个主要原因：1）潜在的生物活性，例如橙油中发现的多甲氧基黄酮的抗炎和抗癌作用，以及柠檬、酸橙和佛手柑油中的香豆素；2）与精油中发现的呋喃香豆素有关的化妆品应用的光毒性调节。到目前为止，图1中列出的常见OHCs与挥发性组分相比更复杂，但研究较少，因为商业上无法获得，成本非常高，并且对于不同的冷榨柑橘精油具有很强的物种特异性。所有这些因素都表明，非挥发性OHCs馏分的分析优于真实性研究。此外，由于化学结构的相似性，通过液相色谱法进行OHCs分析面临许多共洗脱情况。最近，高分辨率质子NMR已与其他化学计量学方法相结合，用于研究天然产物的真实性或来源。虽然1H核磁共振（NMR）可以通过简单的样品制备提供全面的数据，这种分析技术需要高度熟练的操作员，并且对于大多数质量控制（QC）部门来说，在仪器和数据分析方面成本过高。另一种值得注意的OHCs分析方法是超临界流体色谱（SFC）与串联质谱联用。这种方法灵敏度高，分析时间短得多，而且用量少了有机溶剂。然而，维护串联质谱的成本和精力也超出了大多数QC部门的承受能力，并且仍然通过SFC-UV进行共洗脱。此外，HPLC系统在香精香料行业比SFC更容易获得，因为它对不同分子具有多功能性。
在这项研究中，收集了124个直接从可靠的柠檬生产商那里供应的正宗柠檬油样品，以及来自不同香精香料公司的30个商业柠檬油样品。通过经过验证的HPLC-UV方法分析所有样品的OHCs组分。目前，柠檬油的主要QC分析因其应用目的而由GC进行测试，真实性尚无定论且缺乏权威性。因此，通过HPLC-UV鉴定和量化OHCs来确定柠檬精油的真伪变得更加有前途和实际适用。利用来自该行业的正宗和商业掺假柠檬精油样品，建立了一个基于不同水平OHCs含量和模式的内部柠檬油数据库。通过比较各种样本中的OHCs概况，确定了OHCs的最重要因素，并进一步建立了一个统计模型来协助认证过程。本研究的主要目的是使用HPLC-UV表征和分析天然柠檬油中的OHCs，并使用真实样品建立OHCs概况和统计模型。首先，进行了GC和HPLC分析，以确定来自商业来源的正宗和掺假柠檬精油的概况。然后，使用正向逐步逻辑回归（FSLR）对不同真实柠檬油样品的OHCs进行了完整的数据分析，以从OHCs中选择最稳健的预测因子进行目标真实性分类。最后，在样本池上使用了5倍交叉验证方法，以验证FSLR结果中预测变量的性能。本研究提供了一种可行、可靠和有效的方法，通过使用HPLC-UV进行靶向OHCs分析来确定全球饮料、食品、香精香料行业使用的柠檬油的真伪。
02
Results
HPLC方法验证
根据初步实验，在大多数正宗的柠檬油样品中鉴定出少量的7-甲氧香豆素、异茴芹内酯和佛手柑内酯。因此，有必要验证本研究中使用的HPLC方法。根据国际人用药品注册技术要求协调会议制定的指南，该方法在线性、LOD、LOQ、准确度和回收率、日内和日间精密度以及重现性方面进行了验证分析程序验证。
根据标准化合物的校准曲线确定线性。由于柠檬精油中不同OHCs的浓度差异很大，因此根据它们在柠檬和酸橙精油中的典型范围设定了浓度范围（表1）。采用回归分析评估线性度。所有15种标准化合物的5点校准曲线在浓度范围内均呈线性，相关系数较高（R2）值高于0.999。进一步稀释标准化合物以确定灵敏度。LOD设置为信噪比的3倍，LOQ设置为信噪比的10倍。表1中的结果表明，这15种化合物的LOD在0.0134～0.0706 mg/L的范围内，它们的LOQ在0.01073～0.1363 mg/L之间。
表1 15种标准化合物的线性和灵敏度数据
表2说明了该HPLC-UV方法的准确度、回收率、精密度和重现性结果。准确性研究是为了检验通过分析方法获得的实验结果与真实值的接近程度。本研究在校准曲线范围内分析了每种标准化合物的三种不同浓度，分别为低、中和高浓度。注射一式三份。如表2所示，平均回收率在95.09%−106.22%范围内，相对标准偏差（RSD）小于5.62%。通过三种不同浓度（低、中、高水平）研究日内（重复性）和日间（中等精密度）变化的精密度。为实现日内精密度，在相同实验条件下，在同一天进样标准化合物溶液3次。保留时间的RSD值在0.00%～0.13%的范围内。对于峰面积，RSD在0.02%～5.62%之间变化。在相同的实验条件下，在3个不同的日子里评估日间精密度。保留时间的RSD为0.00%～0.60%。对于峰面积，它在0.07%～4.41%的范围内。
表2 标准化合物的准确度和精密度数据
柠檬和酸橙精油中OHCs含量的比较
OHCs可用作某些柑橘物种的标志化合物。测量了柠檬和酸橙精油中OHCs的含量。表3说明了工业冷榨柠檬油和酸橙油之间OHCs的比较。石灰油中的OHCs含量比柠檬油高约10倍。如引言中所述，柠檬油中被认为不存在7-甲氧香豆素、异茴芹内酯和佛手柑内酯，但在柠檬油中鉴定出少量这三种化合物。由于柠檬油来自可靠的柠檬加工商，因此不同的砧木或柠檬杂交种可能是这三种化合物存在的原因。从表3中可以看出，柠檬油中7-甲氧香豆素、异茴芹内酯和佛手柑内酯的浓度远低于酸橙油中的浓度。
表3 冷榨柠檬油和酸橙油中的OHCs
正品和掺假柠檬油样品的挥发物和OHC含量比较
表4说明了通过GC-FID在柠檬油A和柠檬油X中鉴定出的挥发性化合物。不出所料，这两种油的GC曲线以及数量（百分比）非常相似。主要成分是D-柠檬烯，两个样品的含量约为67%。其他单萜、倍半萜、醇和酯类无显著差异。对伞草是柠檬油氧化的指示，柠檬油X（0.26%）远高于柠檬油A（0.07%）。对伞花烯在典型冷榨柠檬油中的含量约为0.2%～0.5%。这两种柠檬油在GC分析中的其他明显差异是香茅醛和柠檬醛（香叶醛和香叶醛）。这些醛在柠檬油X中的含量低于柠檬油A。这些代表性醛的浓度仍在典型柠檬油的范围内。更重要的是，香叶酸和香叶酸之间的比例为0.61和0.66，这非常接近，并且与正宗柠檬油中的柠檬酸比例一致。因此，很难根据GC分析得出柠檬油X是否存在掺假的结论。
柠檬油A和柠檬油X中OHCs含量的比较在表5柠檬油X中发现的总OHC含量比柠檬油A低约34%。柠檬油X中的鱼腥素、异山羊毛素和白藜芦醇含量高得多，而其他OHC化合物与柠檬油A非常相似或更低，这表明柠檬油是与少量的石灰油混合，同时掺入蒸馏油或萜烯，使其更天然。从这个例子中，掺杂分析显示，鱼腥素，异山羊皮素，白藜芦芦醇和总OHC的含量可以被视为确定柠檬精油真伪的预测因子。
表4 挥发性化合物比较
表5 OHCs比较
正宗柠檬油和市售柠檬油中主要OHCs化合物的分析
为了确定这4个预测因子对于柠檬油的真伪或掺假判断是否可靠和准确，收集了124个正宗柠檬油样品，从不同的香精香料公司收集了30个商业柠檬油样品。表6列出了正宗柠檬油和市售柠檬油之间的OHCs含量比较。正宗柠檬油中的疝气含量略低于商业油中的疝气含量。正宗柠檬油中的异平宁和佛手柑烯浓度显著较低，而正宗柠檬油中总主要OHCs含量远高于商业柠檬油。
表6 来自正宗柠檬油和商业柠檬油的OHCs
为了进一步区分和分类不同柠檬精油的真伪或掺假，FSLR被用作探索性数据分析。四个建议的预测变量可以单独使用，也可以一起用作预测二进制结果的变量。二元结果是正品或掺假柠檬油的概率。逻辑回归计算给定多个预测变量中的单个结果（真实或掺假）的概率，如下所示：
其中，P（Yi）是Y是正宗或掺假柠檬油的预测概率；x是变量（预测变量）的观测数；a和b是根据数据估计的系数；c是根据数据估计的常数。
在逻辑回归中，使用称为最大似然（ML）的基于微积分的函数来查找函数（系数和常数），该函数将最大限度地提高根据观察到的x预测Y概率的能力。
表7显示，在第1步中，总OHCs浓度是最有效的单个预测因子，其本身给出了92.9%的正确分类。在第2步中，通过添加异茴芹内酯，这两个预测因子共同实现了100.0%的准确率，对正宗或掺假的柠檬油进行分类。两个步骤后，逐步逻辑回归分析停止，因为添加其他预测变量无法进一步改进分类。表8显示了每个单独预测变量以及两个组合预测变量的计算逻辑回归结果和分类准确性。
表7 FSLR模型系数
表8 逻辑回归计算结果和准确性
探索性分析后，使用Python3.10.4和Scikit-learn1.1.1通过5倍交叉验证测试了逻辑回归分类预测的性能。交叉验证是一种重新采样过程，用于评估机器学习模型在有限数据样本量上的性能。对于5倍交叉验证，所有数据样本被洗牌并随机分为5组。使用4组作为训练数据来计算模型。最后一组作为测试数据，评价生成模型的分类精度。对于每组预测变量，此过程进行了5轮，以获得平均准确率分数及其标准差。表9说明了从逻辑回归到交叉验证测试的所有可能的预测因子模型的性能。异茴芹内酯和总OHCs的组合仍然是最佳预测因子，其准确率为98%，标准差为0.02。当向该组合添加更多预测因子时，预测没有改善，这与探索性分析的结果相同。因此，通过基于当前柠檬油样本池构建的模型研究异麦角蛋白和总OHCs浓度来识别柠檬油的真伪是非常有前途的。
表9 不同逻辑回归模型的交叉验证准确性提高了5倍
03
Conclusion
总之，数据和数学模型表明，OHCs可能是确定柠檬油真伪的有效标志物。在这项研究中，通过HPLC-UV分析了154种柠檬油，然后利用获得的数据构建了逻辑回归模型，以分离和鉴定柠檬油的真伪。经过FSLR的分析，发现异茴芹内酯和总OHCs浓度的组合是区分真伪和掺假的非常可预测的标志物。此外，五重交叉验证还证明，上述两个预测因子能够以98%或更高的准确率对真伪和掺假进行分类。
与柠檬油的挥发物不同，OHCs馏分更难通过GC和GC/MS技术进行分析，但可以被视为解决掺假问题的巨大优势。本文研究的所有柠檬油样品均通过行业规模加工并在美国市场流通，能够代表当前的市场质量。由于工业样品数量相当多，本研究并未将特定化合物作为真伪确定的标志物，而是旨在建立一个数学模型，其中包含OHCs的详细分析数据。柠檬油是农产品，由于嫁接技术不同或环境变化等各种因素，可能会发生一些成分变化，如果有新一批柠檬油经过加工和分析，该模型中的数据集可以在每次更新。因此，所建立的模型可以作为一种方便、有用且具有高度可信度的工具，为工业QC在不久的将来通过有针对性且具有成本效益的HPLC-UV分析来识别柠檬油的真伪。
Oxygen heterocyclic compounds (OHCs) in lemon oils are important markers in targeted HPLC analyses for authentication
Siyu Liua,*, Shiming Lib, Chi-Tang Hoa,*
a Department of Food Science, Rutgers University, New Brunswick 08901, USA
b College of Biology and Agricultural Resources, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, China
*Corresponding author.
Abstract
Lemon oils are broadly used as flavoring agents in beverages, foods, cosmetics and pharmaceuticals, yet the adulteration of natural, particularly cold pressed lemon oils is very common in the industry due to its unmet demand and high cost. Nowadays, most quality control (QC) analysis of lemon oils is conducted by gas chromatography (GC) analysis, which is far from a reliable method. Oxygen heterocyclic compounds (OHCs) in non-volatile fraction are gaining increasing attention in authentication process because of the nearly finger-printing profiles of OHCs in cold pressed citrus essential oils. Our goal in this study was to identify OHCs using high performance liquid chromatography (HPLC) in lemon oils, establish OHC profiles, perform stepwise logistic regression analysis (SLRA) and build effective predicting model and further determine adulterated lemon oils by referencing the OHC profiles and established models. After HPLC analyses, profiling and SLRA modeling of 154 OHCs samples of industrial lemon oils, we found that the combination of isopimpinellin and total OHC concentration are essential and robust predictors to differentiate authentic samples from adulterated lemon oils with a success rate of 98% from the 5-fold cross validation. This study provided a reliable and efficient method in determining the authenticity of lemon oils.
Reference:
LIU S Y, LI S M, HO C T. Oxygen heterocyclic compounds (OHCs) in lemon oils are important markers in targeted HPLC analyses for authentication[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(2): 9250027. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250027.
翻译： 田雨欣（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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