神经科学领域的关键目标是绘制完整的哺乳动物神经回路，但传统技术存在三大核心限制：荧光蛋白在组织透明化过程中易淬灭，无法有效标记精细神经结构（如长距离轴突投射）。基于 IgG 抗体或纳米抗体的标记方法，因分子量大（IgG 约 150kDa）导致组织穿透性差，信号随组织深度显著衰减。现有 AAV 稀疏标记技术的标记密度随时间逐渐增加，导致样本间差异大，难以实现单个神经元的精准形态重建。高亮的小鼠全脑/全身神经元快速化学荧光标记方法LINCS可解决以上问题。
LINCS实验流程
向 Cre 工具鼠（如 Sert-Cre、DAT-Cre）的目标脑区注射 Cre 依赖型 AAV（携带 seTurboID 基因），表达周期仅需3 周（传统荧光蛋白需 > 1 个月）。
体内生物素化：小鼠饮用含 2mM 生物素的水 1 周，使 seTurboID 催化生物素结合到目标神经元蛋白上。
整体染色：使用荧光偶联的单价链霉亲和素进行染色，3 天即可完成（42℃加热可加速），无需传统抗体的多周孵育。
组织透明化与成像：采用 DISCO透明化技术结合光片显微镜成像，全脑成像时间约8 小时。
CRISPR-Cas9介导的稳定稀疏标记系统
为实现单个神经元的精准重建，开发了基于 AAV 的 Cre 敲除系统解决传统稀疏标记不稳定的问题：
技术原理：通过AAV表达SaCas9和靶向Cre基因的多条sgRNA，在Cre工具鼠中特异性敲除部分神经元的Cre，使仅保留Cre活性的神经元可被后续Cre依赖载体标记，实现稳定稀疏标记。
调控方式：通过以下 3 种方式精准控制稀疏度：
调整 Cre-KO AAV 的滴度；
改变 Cre-KO 的作用时间；
调整 sgRNA 的数量。
传统双AAV稀疏标记因病毒持续表达，2个月后标记细胞增加超30%，稳定性差。而CRISPR-Cas9 Cre敲除系统通过永久失活部分神经元的Cre基因，实现不可逆的稀疏标记，使标记细胞数量长期稳定，显著提升了标记的持久性与可靠性。
LINCS应用场景
脑内神经连接图谱绘制
血清素能神经元：在 Sert-Cre 小鼠中标记 DRN（中缝背核）血清素能神经元，LINCS 可清晰显示全脑范围内的投射。
多巴胺能神经元：在 DAT-Cre 小鼠中标记 VTA（腹侧被盖区）和 SNc（黑质致密部）多巴胺能神经元，LINCS 标记的轴突信号强度在半脑样本中是 iDISCO + 的 1.8 倍且能精准重建纹状体（STR）的局部分支模式。
GABA 能神经元：在 Vgat-Cre 小鼠中标记 VTA GABA 能神经元，成功区分中间神经元和投射神经元。
长距离神经投射标记
皮质脊髓束：向 CaMKII-Cre 小鼠颈髓（C7-C8 节段）注射逆行 AAV（AAV2-retro），携带 mem-seTurboID（膜定位 seTurboID），3 周后可清晰显示从大脑运动皮层（M1/M2）、躯体感觉皮层（S1/S2）到脊髓 L3 节段的轴突束及单个轴突，分辨率达单个轴突水平。
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外周神经系统（PNS）标记
全鼠体 PNS 标记：通过静脉注射 AAV-MaCPNS2（外周神经靶向 AAV 血清型），携带 hSyn-mem-seTurboID，3 天后可标记全鼠体的外周神经元，包括皮肤内的感觉神经末梢；胃肠道（小肠、大肠）的肠神经系统；尾巴和爪子的神经纤维，实现中枢与外周神经回路的联合绘制。
与扩展显微镜（ExM）的兼容性
LINCS 可与蛋白保留扩展显微镜（proExM）结合：直接使用荧光偶联链霉亲和素标记，可分辨神经元精细结构；结合 isHCR（免疫信号杂交链式反应），信号强度可进一步提升 2 倍，满足超高分辨率成像需求（扩展后样本体积扩大 100-1000 倍，信号仍清晰）。
该技术整合了多项创新，构建了一套高效解析哺乳动物全脑神经环路的完整流程。通过工程化的溶解度增强型生物素连接酶（如seTurboID）在活体内实现广泛生物素化，结合单价链霉亲和素进行快速、低背景的整体染色，有效解决了传统方法中标记效率低和信号随组织深度衰减的问题。该标记策略与组织透明化技术和光片显微镜相结合，可实现对完整大脑乃至全鼠体标本的高分辨率、大尺度三维成像。同时，开发的基于CRISPR-Cas9的Cre敲除AAV系统，可在基因型小鼠中实现稳定且稀疏的神经元标记，满足单神经元水平精细回路解析的需求。
文献引用
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.08.022
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