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Introduction
灵芝（Ganoderma）是一类重要的药用真菌，具有多种药理作用，包括抗高血压作用。灵芝自古以来被作为中草药使用，现阶段人们对其药效物质和药理作用进行了大量研究，但有关灵芝抗高血压的活性成分及其相关作用机制方面的研究较少，特别是灵芝多肽和抗高血压作用之间的关系尚不明了。
血管紧张素I转换酶（ACE）可将血管紧张素I（Ang I）水解为强效血管收缩剂血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），它与血管紧张素受体1型（AT1R）结合，导致血压升高。因此，抑制ACE活性有望预防和治疗高血压。近年来，人们先后从植物、动物和微生物材料中分离到了可抑制ACE的蛋白或多肽分子，但主要开展了对ACE的抑制作用研究，在具体的体内降血压试验和相关分子机制方面的实证研究还较少。
中南林业科技大学刘高强教授课题组在自主采集的灵芝（Ganoderma lingzhi）新菌株SCIM1006中分离出一个新的具有ACE抑制活性的小分子肽（仅3 个氨基酸，即三肽Ser-Tyr-Pro, SYP）,然后利用自发性高血压大鼠（SHR）动物模型评估了其降压功能，进一步通过基因芯片技术分析了ACE抑制肽的潜在降血压机制，并在相应血管紧张素诱导的人主动脉内皮细胞（HAEC）和血管平滑肌细胞（VSMC）中进一步验证了发挥降血压作用的相关分子机制。
Result and Discussion
灵芝ACE抑制肽的分离和鉴定
本研究以具有自主知识产权的灵芝（G. lingzhi）SCIM 1006菌株为研究对象，通过液体发酵技术获得灵芝菌丝体，用缓冲液进行多肽提取，然后依次用100 kDa和3 kDa超滤膜进行超滤，收集分子量小于3 kDa超滤液，并经脱盐柱、RP-HPLC（Znertsil ODS-3柱）分离纯化，ACE抑制活性跟踪检测和质谱鉴定，获得具有显著抑制ACE活性的灵芝三肽Ser-Tyr-Pro（SYP），其IC50为62.5 μg/mL。
SYP的胃肠液消化稳定性、毒性和生物利用度分析
通过模拟人体胃肠液消化分析灵芝活性寡肽SYP的胃肠液消化稳定性。如图1A所示，由于SYP中Tyr残基是胃蛋白酶的酶切位点，因而在胃液消化时能被胃蛋白酶降解。但SYP在肠液消化时能保持良好的稳定性。利用MTS测定不同浓度SYP对肠上皮细胞Caco-2和人主动脉内皮细胞HAEC的毒性，发现SYP细胞毒性较小（图1B和1C）。采用静脉注射、腹腔注射、灌胃等不同给药方式，以不给药作为空白对照，分析SHR动物模型评价SYP的短期降血压功效（图1D）。由图1E和1F可知，尽管静脉注射的降血压效果明显好于灌胃和腹腔注射，但静脉注射在短时间内（1.0 h）血压出现回升，推测SYP可能被血液中存在的氨肽酶降解而失效。如图1G所示，SYP经静脉注射后，随着时间的延长，SHR血液中SYP浓度逐渐降低。其中，静脉注射1 h后，血清SYP浓度急剧下降。由图1H可知，相较于已灭酶处理的对照组，SYP与血清共孵育1 h后，SYP浓度明显下降，下降幅度高达（50.90±1.03）%，预示SYP可能被血液中存在的某些蛋白酶或氨肽酶降解。但当SYP与血清共孵育4 h后，SYP并未被完全降解。结合上述血压测定结果可推知，SYP具有快速降低血压的特点，但随着时间推移，SYP很有可能被血液蛋白酶或肽酶降解，但血液中残留的SYP浓度足够，被血液输送至靶器官/组织，最终发挥降血压作用。
图1 灵芝菌丝体三肽SYP的胃肠液消化稳定性、毒性和生物利用度分析
SYP体内长期给药降血压功效
本研究建立SHR动物模型，以卡托普利为阳性对照，以SYP改性肽Ac-AFP-NH2（无显著抑制ACE活性）为阴性对照，评价静脉注射长期给药（28 天）的降血压功效（图2A）。SHR经SYP静脉注射28 天后，SHR的收缩压和舒张压均显著降低（P < 0.05）（图2B-C）。
图2 灵芝菌丝体三肽SYP体内长期降血压作用
SYP降血压的分子机制——SHR胸主动脉基因芯片分析
进一步对SHR胸主动脉采样，通过基因芯片技术建立基因表达谱，分析SYP在体内的降血压分子机理。由图3B-E可知，有21 个钙相关下调基因，6 个钙调素相关下调基因。由于SYP抑制了ACE活性，在肾素-血管紧张素系统（RAS）中发现了
ACE
AT1R这2 个下调基因和
calmodulin 1
ACE2
激活蛋白-a
prolyl oligoptidase
AT2R
MAS1这6 个上调基因。SYP处理后，AT1R蛋白表达没有明显抑制，而AT2R蛋白表达增加，cGMP-PKG信号通路中的大部分相关基因如
eNOS
sGC
PKG的mRNA与蛋白表达水平上调，导致血清中NO和cGMP的生成加速（图3F-G）。
图3 灵芝菌丝体三肽SYP体内降血压分子机制分析
SYP降血压的分子机制——HAEC模型中的验证
建立由Ang Ⅰ诱导的人主动脉内皮细胞（HAEC）模型，同时以卡托普利为阳性对照，以SYP改性肽Ac-AFP-NH2为阴性对照，在活细胞内鉴别SYP的作用靶蛋白，并阐明其降血压分子机制。HAEC细胞提取液各项指标检测结果如图4B-E所示，HAEC细胞经SYP处理后ACE活性明显下降，而Ac-AFP-NH2处理对各项指标均无影响。由图4H-J可知，SYP处理显著影响eNOS和ET-1的mRNA转录水平，AT1R表达水平不受影响；SYP对eNOS和ET-1的蛋白表达水平调控与其mRNA转录水平的变化趋势相似；经SYP处理后ET-1和NOX表达显著降低（P < 0.01），eNOS磷酸化水平显著提高（P < 0.01），而改性肽Ac-AFP-NH2无明显变化（P > 0.05）。由图4F和4G可知，SYP显著抑制了AngⅡ有关的NOX活性和表达，从而降低了ROS积累；SYP显著降低AngⅡ诱导的VSMCs钙浓度升高(P < 0.05)。
图4 灵芝菌丝体三肽SYP降血压分子机制的验证
综上所述，在不影响受体AGTR1表达水平的情况下，SYP通过抑制ACE活性，阻断Ang Ⅱ生成，进而激活eNOS/NO/cGMP信号通路，发挥舒张血管功能。同时，由于Ang Ⅱ减少，Ang Ⅱ/NOX2/ROS旁路也受到影响，导致NOX2蛋白/酶活水平下降，从而阻断ROS产生。NO是血管舒张因子，由SYP激活eNOS/NO/cGMP通路产生的NO，未能被ROS转化成ONOO−而被消耗，因而能在体内积累而发挥血管舒张作用。
Conclusion
本研究从灵芝发酵菌丝体中分离得到一种新的小分子降压三肽SYP，其抑制ACE活性IC50值为62.50 μg/mL。SYP具有良好的肠道消化耐受性、良好的生物安全性、生物稳定性和生物利用度，特别是长期给药情况下，SYP对SHR大鼠具有显著降血压作用。进一步研究发现，SYP通过激活eNOS/NO/cGMP信号通路，抑制AngⅡ/NOX/ROS信号通路，进而使Ca2+浓度下调，最终导致血管舒张。本论文从细胞、动物和分子水平较系统地研究了灵芝中SYP的降血压作用，为揭示灵芝抗高血压活性成分及其相关作用机制提供了新的实验依据。本研究也有望为灵芝在创新药和保健食品中的开发提供理论依据，并为其他天然来源的生物活性肽研究提供借鉴。
第一作者简介
伍强，博士，副教授，硕士生导师，主要从事微生物发酵与代谢调控、生物活性肽制备与功效活性分析等科研工作，湖南省食品科学技术学会青委会委员，湖南省微生物学会理事，主持国家自然科学基金青年项目、湖南省自然科学基金项目、湖南省教育厅优秀青年项目、市工程技术研究中心等省市级以上项目9 项；发表学术论文近30 篇，其中以第一/通信作者在Crit Rev Biotechnol、J Agric Food Chem、Food Sci Hum Well等国际权威期刊发表论文10 篇；为Crit Rev Food Sci、Food Chem、J Cell Mol Med、J Nutr Biochem等期刊审稿；申请/授权中国发明专利10 项、国际发明专利1 项。
通信作者简介
刘高强，博士，二级教授，博士生导师，国务院政府特殊津贴专家，湖南省“十四五”重点学科生物学博士点学科带头人、湖南省科技创新团队负责人、湖南省国际科技创新合作基地负责人。入选教育部“新世纪优秀人才支持计划”、“全国林草科技创新领军人才”、湖南省“芙蓉学者”特聘教授、全国林业和草原教学名师、湖南省优秀研究生导师。主要从事微生物生理代谢与发酵应用研究，担任中国菌物学会常务理事、中国菌物学会药用真菌专业委员会副主任、湖南省微生物学会副理事长、《Mycology》和《菌物学报》等期刊编委。主要论文发表在Biotechnology Advances、Nature Communications、Bioresource Technology、Green Chemistry、Journal of Integrative Plant Biology等10余个国际主流期刊上。获湖南省自然科学奖一等奖（排名第1）和中国林业青年科技奖等表彰和奖励。
Discovery and mechanism of anti-hypertensive effect of a novel tripeptide (SYP) from medicinal fungus Ganoderma lingzhi
Qiang Wua,b,c,#, Feijun Luod,#, Jia Huanga,b, Ping Huanga,b, Yongnan Liua,b, Xiaoling Wanga,b,*, Gaoqiang Liua,b,*
a Hunan Provincial Key Laboratory of Forestry Biotechnology and International Cooperation Base of Science and Technology Innovation on Forest Resource Biotechnology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China
b Microbial Variety Creation Center, Laboratory of Yuelushan Seed Industry, Changsha 410004, China
c College of Food and Chemical Engineering, Shaoyang University, Shaoyang 422000, China
d Laboratory of Molecular Nutrition, National Engineering Laboratory for Rice and Byproducts, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China
*Corresponding authors.
Abstract
Ganoderma lingzhi is a new species of the prize medicinal mushroom Ganoderma (Agaricomycetes). Using angiotensin Ⅰ-converting enzyme (ACE) as a target, a tripeptide Ser-Tyr-Pro (SYP) was discovered with preponderant ACE inhibitory activity with an 50% inhibiting concentration (IC50) value of 62.50 μg/mL attribute to the formed salt bridge and hydrogen bonds between SYP and ACE. SYP even maintained superior bioactivity after intestinal digestion, and exerted no cytotoxicity, but presented incomplete bioavailability in blood of spontaneous hypertensive rats (SHRs). Furthermore, it performed antihypertensive effect in vivo by inhibiting the influx of Ca2+ through activating endothelial NO synthase (eNOS)/NO/guanosine 3’,5’-cyclic monophosphate (cGMP) pathway, accompanied by attenuating angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ)/NADPH oxidase (NOX)/reactive oxygen species (ROS) pathway. This work not only discoverers a novel pharmacological ingredient from medicinal mushroom G. lingzhi for hypertension therapy, but also provides an insight into molecular mechanism of the ACE inhibitory peptide (ACEIP) on lowering blood pressure.
Reference:
WU Q, LUO F J, HUANG J, et al. Discovery and mechanism of anti-hypertensive effect of a novel tripeptide (SYP) from medicinal fungus Ganoderma lingzhi[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(2): 9250032. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250032.
本文编译内容由作者提供
编辑：王佳红；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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