在过去的几年中，FDA和EMA批准了多种基因治疗(Gene Therapy, GT)药物。ClinicalTrials.gov网站上显示有1000多基因治疗临床试验项目正在进行，覆盖从肿瘤到隐性遗传病等多个适应症。基因治疗通常会使用病毒载体递送，可能存在一些安全问题，比如插入性突变的风险。监管机构建议对基于病毒载体的基因治疗产品进行插入性突变风险评估。
美国毒理学学院第43届年会中围绕如何应对基因治疗领域不断出现的挑战进行了讨论。会议全面回顾了重组腺相关病毒载体（rAAV）和慢病毒载体（LV）相关的致突变性和致癌性风险的历史和当前认知，并通过使用rAAV和LV作为案例，展示了如何在药物开发过程中评估这种风险。本文略作分享。
当病毒载体意外整合到基因组中时，可能会发生载体介导的遗传毒性，并可能会激活原癌基因，和/或导致插入性突变，进而可能破坏或失调基因表达，引发克隆扩增和肿瘤形成。如下图所示。载体整合到基因组中涉及病毒和非病毒因素。病毒因素包括载体设计（是否存在强增强子和/或启动子序列、是否存在剪接供体或受体位点以及有利于替代转录本生成的聚腺苷酸化信号）以及宿主整合位点（IS）或插入位点特征。非病毒因素包括转基因功能、靶细胞、疾病状态、年龄以及表观遗传因素等。
AAV遗传毒性、整合和成瘤风险
AAV于1965年被发现，被认为是非致病性的。天然存在的AAV的组织嗜性取决于AAV的血清型。到目前为止，已鉴定出13种AAV（AAV1-AAV13）血清型。全球超过80%的人群对AAV呈阳性反应，AAV基因组在人类肿瘤和正常组织中均有发现，但缺乏克隆性。在20世纪90年代初，野生型AAV被发现具有高倾向整合到人类19号染色体的AAVS1位点。近年来，rAAV已被用于基因递送，目前已有九种相关产品获批。最近获批的AAV基因治疗药物是Kebilidi，于2024年获批。rAAV的整合较为罕见，主要是因为它们缺乏病毒载体中用于复制的Rep区域。然而，在人类中，当整合发生时，通常出现在染色体17和19的热点区域（hotspots），如CpG岛或核糖体DNA重复序列附近。
在小鼠中，rAAV倾向于插入基因调控元件、热点区域或癌基因附近。在一系列针对黏多糖贮积症VII型（MPSVII）、鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）缺乏症、桑德霍夫病或甲基丙二酸血症的小鼠模型的研究中，新生小鼠接受治疗后，13-24个月内出现了剂量依赖性的肝细胞癌（HCC），主要由于它们对rAAV整合和肿瘤生成的敏感性。这些研究还表明，在易患肿瘤的小鼠品系中，载体设计中的特定成分、载体DNA相关污染物等可能会增加载体整合和肿瘤生成的风险。在小鼠中，rAAV的整合主要发生在Rian位点内的Mir341。由于人类不携带Rian位点，因此rAAV在小鼠Rian位点整合导致的HCC与人体相关性尚不明确。
有趣的是，在接受rAAV基因治疗的大动物中，尤其是接受单次基因治疗的B型血友病和A型血友病犬（观察期为8-10年），以及接受rAAV1、5或8基因治疗的非人灵长类动物（观察期为1-5年），并未报告HCC的发生。在单次接受AAV基因治疗的血友病犬中，观察到肝脏中有超过1700个整合位点，且在五只犬中发现了靠近细胞生长相关基因的扩增细胞克隆，但未出现肝结节或转化。
目前，许多rAAV基因治疗药物正处于临床试验的不同阶段，其中大多数处于I/II期。用于基因递送的最常用AAV血清型是AAV2，其次是AAV8、AAV9和AAV1。目前为止，尚未在临床试验或已上市药物中检测到与rAAV基因治疗相关的遗传毒性。
需要明确的是，接受AAV基因治疗的患者中确实有HCC的发生，尤其是肝脏靶向治疗。这些患者发生HCC的主要原因包括：1）既往有病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）、乙型肝炎（HBV）、丙型肝炎（HCV）或人类免疫缺陷病毒（HIV）病史；2）存在晚期肝纤维化或早期肝硬化；3）野生型AAV2在癌基因中的整合。需要注意的是，目前尚不清楚缺乏Rep的rAAV基因治疗载体是否会在人肝细胞中整合到癌基因中。AAV在人类基因组中的整合位点可能与小鼠基因组中的整合位点不同。总之，AAV与人类HCC风险增加之间的关系存在较大争议，持反对意见的认为AAV的存在仅仅是相关性而非因果关系。
LV遗传毒性、整合和成瘤风险
LVs是逆转录病毒载体（RVs）的重组形式。40多年来，RVs已被广泛用于基因治疗，主要用于单基因疾病、癌症和传染病。RVs能够提供稳定（长期）且高效的转基因表达。然而，第一代用于基因治疗的RVs因插入性突变导致的不良事件而受到关注。从2003年到2011年，RV递送的基因治疗被证明会导致细胞增殖、染色体异常和致癌事件，包括骨髓增生异常综合征和白血病，主要是由于插入导致的基因表达水平的改变。
2007年，研究发现RVs的共同插入位点（CIS）主要集中在特定区域，尤其是靠近MDS-EVI1、PRDM16、LMO2和CCNE2基因位点，但并非所有插入位点都与肿瘤风险增加相关。此外，CIS主要出现在转录活跃区域。随后，为了克服早期RVs的安全性问题，研究人员开发了安全表现更好的RVs，例如改良的LVs。与其他仅能转导分裂细胞的RVs不同，LVs可以转导分裂和非分裂细胞，同时仍能提供稳定（长期）且高效的转基因表达。
目前，LVs主要用于体外细胞修饰，以生成用于细胞治疗的嵌合抗原受体（CAR）T细胞。LVs源自HIV，但它们是复制缺陷型的，并且经过多年的发展，已经从第一代、第二代进化到第三代，遗传毒性风险更低。第一代LVs由于在构建中包含gag、pol和调控辅助蛋白（vif、vpr、vpu和nef），并且这些蛋白受细胞巨化病毒（CMV）启动子的调控，因此具有较高的整合风险。第二代和第三代LVs的整合风险较低，因为调控元件已去除。其中，第三代LVs也被称为自灭活LVs（SIN LVs），缺乏导致较高遗传毒性风险的LTR区域中的增强-启动子元件。尽管如此，由于LVs可能意外生成具备复制能力的病毒，以及非随机基因组整合，LVs仍存在一定风险。
LVs的整合和遗传毒性机制包括跨转录基因整合，主要在内含子中。SIN LVs可以通过以下方式导致遗传毒性：1）当它们在内部位置携带强增强子-启动子序列时，上调插入位点（IS）周围基因的表达；2）诱导异常剪接和/或靶基因内源性转录本的提前终止，可能导致功能丧失或功能获得性突变。
为了克服新一代LVs的遗传毒性风险，目前正在开发非整合型LVs（NILVs）。NILVs旨在用于疫苗接种、癌症治疗、定点基因插入、基因破坏策略等。它们是通过在pol的整合酶区域引入突变生成的，这些突变分为I类或II类。I类突变阻止整合酶活性、基因组DNA结合和载体DNA结合，以及LVs整合酶的多聚化。II类突变不仅损害整合，还影响许多其他病毒生命周期。I类突变更适合用于生成NILVs。尽管NILVs被设计为非整合型，至少不能通过整合酶机制，但还是存在一些非整合酶依赖的整合，通常发生在染色体断裂位点，通过非同源末端连接（NHEJ）介导。潜在解决方案包括抑制双链断裂修复途径中的细胞因子，或限制比超螺旋DNA整合效率更高的线性载体DNA。
迄今为止，FDA已批准了13种慢病毒载体细胞疗法，其中最新的一种是TECELRA®，这是首个获得FDA批准用于实体瘤治疗的细胞疗法。截至2024年11月，所有FDA批准的LV修饰细胞疗法中，只有SKYSONA（用于治疗肾上腺脑白质营养不良[CALD]）与人类的插入性突变相关。SKYSONA（Elivaldogene autotemcel或Eli-cel）是一种自体体外修饰细胞疗法，使用lenti-D LV将携带ABCD1基因的cDNA添加到患者自身的CD34+造血干细胞中，然后将修饰后的细胞回输到患者体内进行治疗。在SKYSONA的临床试验中，67名患者中有3人在治疗后5年内发展为造血恶性肿瘤，所有3例均为Lenti-D LV介导的插入性癌变。
在2022年FDA咨询委员会会议上，与Bluebird bio和细胞治疗领域的专家讨论了SKYSONA的致癌机制，认为其与位于ABCD1 cDNA上游内部位置的强病毒启动子MNDU3有关，该启动子驱动所有造血谱系的高水平基因表达。整合主要发生在MECOM基因附近，这是一个已知的髓系癌基因，在54名接受治疗的患者中，有53名发生了整合。其他插入位点包括PRDM16、MPL和MIR100HG。
CALD是一种进行性、不可逆且致命的神经退行性疾病，主要影响年幼男孩。SKYSONA在临床试验中表现出非常高的有效性，约87%的治疗患者在长达7年内保持无事件生存，与早期活动性CALD的未治疗患者相比，CALD相关事件减少了72%，大多数患者保持基线神经功能和正常智商。SKYSONA显著优于现有的异体造血干细胞移植，且对于干细胞移植，患者需要等待很长时间才能找到匹配的细胞供体，或者接受不匹配的细胞供体，这会导致极高的移植物抗宿主病风险。而SKYSONA使用患者自身的细胞，消除了等待时间和移植物抗宿主病的风险。尽管存在肿瘤生成风险，但FDA认为SKYSONA对这种侵袭性和致命疾病的好处大于肿瘤生成风险，最终获得批准。
关于插入突变的监管考虑
在2022年开会时，FDA批准的8种基因疗法，其中7种未报告有致癌性，另外1种存在插入突变，但由于对患者有显著获益而获批。
rAAV载体整合导致的致癌性仅在新生小鼠中被报道，且与小鼠特有的Rian基因座附近整合有关，而人类并不存在该基因座，因此在人类中尚未发现由其整合导致的肿瘤形成。此外，在接受治疗后长达10年的大动物（如血友病犬）和长达6年的非人灵长类动物中，也未见有肿瘤形成的报道。
LVs主要整合到转录活跃的基因中，且多在内含子区域。载体构建中存在强启动子-增强子元件是导致整合和高致瘤风险的主要因素。
通常情况下，FDA可能会要求对基因疗法的基因组完整性进行评估，包括大片段插入或缺失、外源DNA整合、染色体重排以及通过评估克隆扩增或不受控增殖（仅针对体外修饰细胞）来判断潜在的致癌性/插入突变风险。目前，FDA尚未出台关于具体检测方法或检测指标要求（例如，cut off points）的明确指导。
由于存在整合和致癌的低风险，FDA及其他监管机构会根据证据权重（WoE）要求对基因疗法患者进行5至15年的长期随访。
LV基因治疗产品致突变性和成瘤性评估
与AAV不同，LV载体能够将遗传信息整合到宿主基因组中。LV也因其能够稳定地将基因引入细胞并在细胞发育过程中传递给子代细胞而备受青睐。与早期的RVs相比，目前使用的第三代LV载体引入了多种元素和改良方案，显著提高了其用于基因治疗的安全性。
在LV载体基因治疗产品临床前评估致突变性和成瘤性的方法很多，比如采用体外工具评估载体整合和细胞转化潜力，同时结合体内组织的整合位点分析（ISA），并采用以上结果开展致突变性和成瘤性风险的WoE评估。常用体外插入位点分析方法优缺点如下表所示。此外，在细胞和基因治疗的临床前安全性评估中，动物模型的选择及其对终点（如成瘤性）的潜在影响也应被考虑。
基于病毒的基因治疗载体：致突变性/致癌性风险评估的监管视角
一般药理学与毒理学评估的作用
基于病毒的GT产品的载体整合风险，是需系统解决的非临床安全性问题之一。对载体潜在整合风险的初步评估，始于对GT载体的全面表征，包括但不限于载体设计、关键质量属性、主要放行标准，以及病毒基因组物质转运至细胞核的固有能力、病毒蛋白的可获得性，或其与细胞蛋白相互作用介导病毒遗传物质转运和/或整合的能力。
与AAV等生命周期中无DNA整合步骤的病毒载体相比，慢病毒等以DNA整合为生命周期一部分、经工程改造的GT载体，具有更高的插入突变和致癌风险。
产品特性相关信息将为初步药理学和毒理学研究的设计与实施提供依据。在产品开发早期，早期研究和确定性研究的累积非临床数据，将指导后续是否需要开展额外的载体整合和/或致瘤性研究。具体而言，对药理学、生物分布、药代动力学和毒理学研究的细致分析，是制定非临床策略、决策是否需进一步评估靶向和非靶向组织/器官中载体整合、致突变性、遗传毒性和/或致癌性风险的核心。
这种整体的WoE方法遵循分步、整合的决策流程，以科学为基础、数据为驱动。需注意，特定GT产品的具体特性将决定非临床研究策略的方向，只要有科学依据，策略可灵活调整。
在某些情况下，一般毒理学和其他非临床研究的观察结果可能表明，载体可能整合到影响细胞形态和生理功能的基因组位置，包括基因表达变化、细胞活力和增殖改变、持续性变化、器官重量/大小改变，和/或异常病变的出现，或导致器官毒性。对于观察到的任何肿瘤或增生性病变，应调查其起源以及载体是否对肿瘤发生有影响。此外，还应考虑联合治疗的潜在毒性、研究动物和/或目标人群的免疫调节状态，以及特定疾病适应症/特定目标人群，这些因素可能会加重载体相关毒性或调节插入突变风险。
载体整合与致癌风险评估的非临床考量
评估载体整合及插入突变、致癌风险时，需考虑的主要因素包括：GT载体是否为已知的整合型或非整合型载体、其固有的组织嗜性、是否存在基因组编辑组件、载体骨架设计、给药途径、给药剂量水平、长期存续潜力、靶细胞/组织/器官对插入突变的敏感性，以及目标人群中易导致肿瘤形成的风险因素。
若有科学依据支持开展额外的载体整合和致癌性研究，需重点考虑以下非临床研究要点：1）非临床用产品（如早期版本或替代载体）与拟临床用产品的可比性；2）所选动物种属/疾病模型对目标适应症/患者人群的代表性；3）研究设计与实施要素，包括足够的研究持续时间（肿瘤形成所需）、设置合适的平行对照组、每组足够的动物数量（以确保肿瘤形成本底发生率等生物学观察结果的统计学意义）；4）研究终点；5）如果可行，非临床研究应尽可能与临床方案一致。
研究用的非临床载体应在载体组成、病毒基因组滴度、生产工艺、最终制剂与储存条件、转导和/或编辑效率等方面，与拟临床用载体尽可能一致，并符合主要产品放行标准。
选择动物种属或模型（包括用于评估插入突变的细胞/组织类型）时，需重点考虑：与人类的比较生理学/病理生理学差异、对载体转导和/或基因组编辑的允许性、对产品的药理反应，以及临床递送系统或流程的可行性。
载体和转基因的生物分布评估是重要环节，可为是否需要开展整合和致癌性研究提供依据。设计非临床研究时，应采用灵敏的定量方法检测相关动物种属的靶向和非靶向组织中的产品DNA序列，并妥善存档/储存收集的组织/器官，以备未来可能的载体整合等分析。若载体持续存在，药物研发者应采用基于风险的方法评估整合和致癌潜力。有关设计、实施和解读载体生物分布研究的更多指导，可参考《Guidance for Industry: Long-Term Follow-up After Administration of Human Gene Therapy Products (2020)》和《International Pharmaceutical Regulators Programme (PRP) Reflection Paper: Expectations for Biodistribution (BD) Assessments for Gene Therapy Products (June 2018)》。
插入突变与致癌风险的分步评估方法
用于评估载体整合风险的方法，应根据载体GT产品的具体生物学特性确定，包括靶转导细胞、这些细胞的生长动力学潜力，以及转基因表达动力学（若转基因具有生长因子功能，则尤为重要）。一般而言，若某种测试方法能提供有用信息，帮助更好地理解载体基GT产品的插入突变风险和/或致癌潜力，则可考虑采用。
ICH S2 (R1)中描述的标准遗传毒性评估方法不适用于病毒载体，因为这些技术主要关注DNA损伤或突变，且适用短时间暴露。载体介导的突变可能需要数周、数月甚至数年时间。用于检测载体介导遗传毒性的检测方法应能够可重复地定量插入性突变、测量基因功能的获得或丧失，并确定插入在染色体中的位置。遗憾的是，监管机构尚未制定针对载体介导遗传毒性风险评估的具体指南，也没有明确检测方法。根据病毒载体的不同，可使用多种检测方法来评估遗传毒性。对于基因编辑疗法，这些检测方法包括但不限于全基因组范围的非靶向修饰分析（如插入/缺失定量和/或寡核苷酸整合）、插入位点分析、分子易位检测（用于评估靶向位点之间或靶向位点与非靶向位点之间的易位事件）、核型分析、成纤维细胞软琼脂转化试验或低附着生长（GILA）试验以及IL-2细胞增殖试验。
体外永生化试验（IVIM）和遗传毒性评估替代试验组合（SAGA）是两种常用于评估整合型载体致突变潜力的体外试验。这些研究结果可与长期非临床体内研究的安全性终点（如肿瘤形成的大体和微观证据、载体和转基因在靶向和非靶向组织中的持续性，以及任何可能与基因组不稳定性或插入突变相关的延迟毒性）相关联。
开展整合位点分析可确定载体整合的频率和位置，并可根据所用方法提供克隆扩增相关信息。
载体整合和/或核酸酶介导的编辑事件的表征，可根据情况采用基于测序的方法和正交方法，包括计算机预测、深度测序或全基因组测序，以及生化和细胞方法。
从临床角度来看，基于载体的持续性、整合和/或基因组修饰，可能需要进行长期随访（LTFU），以评估长期风险和延迟不良事件。
插入突变与致癌风险评估的挑战与未来考量
评估多样化的AAV或LV GT产品致癌风险的挑战包括：确定致癌作用机制/过程；在选择评估致瘤性/致癌潜力或预测临床结果的最相关体外方法和动物模型方面，缺乏科学共识。目前仍需更好地理解人类面临的风险、致癌性的潜在机制和影响因素，以及降低风险的潜在途径。建议鼓励科学界进一步研究这些问题，并在公共领域共享数据。
GT产品研发者必须在整个产品生命周期中，与药品监管机构保持密切合作，尽早并持续提供反馈。这需要研发者熟悉监管机构的当前思路和监管框架、指导文件，并利用机会通过会议（正式或非正式）与监管机构就所研发GT产品的特定问题进行沟通。这些互动和会议的主要目标是获得监管机构的有用反馈，帮助药物研发者成功提交IND申请，并开发出有效且安全的药物产品。
研发者在IND申报中常见的缺陷通常包括：评估目标人群风险的信息不足，包括产品表征不充分、非临床安全性数据有限或缺失、安全性研究报告不完整、非临床研究设计不当和/或实施不佳（如测试产品与拟临床用产品存在重大差异、给药途径不相关、剂量水平不合适、研究持续时间不足、测试系统不适当/不相关、终点无临床意义）。
总之，载体基GT产品插入突变和致癌风险的非临床评估应遵循全面的WoE方法，并牢记非临床研究的设计目的是支持特定产品用于特定临床适应症的给药。
药理毒理开发1-6群已满，7群还有100多名额，进群的加微信，备注姓名+企业名称+专长领域。比如王**+A企业+注册或毒理。名额有限，已经在1-6群的朋友就不要跨群了。
热门跟贴